基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合GEO芯片分析干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的機(jī)理和分子靶點(diǎn)

張澤鑫,吳汶豐,謝丹,方舒涵,徐筍晶

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院傷寒教研室,廣東 廣州 510405)

2型糖尿病是以慢性高血糖為主的代謝性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，暫無(wú)特效穩(wěn)定的治療與預(yù)防方法[1]。然而2型糖尿病在我國(guó)的發(fā)病人數(shù)不斷增多，預(yù)計(jì)在2030年將達(dá)到4 200萬(wàn)[2]，且其并發(fā)癥及死亡率也不斷攀升，亟待尋求有效的預(yù)防與降糖治療方案。隨著中醫(yī)藥控制2型糖尿病患者血糖的效果越發(fā)顯著且副作用較小，采用中醫(yī)藥治療2型糖尿病也日益成為現(xiàn)在的研究重點(diǎn)。

2型糖尿病在中醫(yī)屬“消渴”范疇，其最核心的病機(jī)便是中滿內(nèi)熱，脾氣損傷。由于現(xiàn)代人多食肥甘厚味，脾胃功能受損，運(yùn)化失常，因而食郁體內(nèi)致使?jié)駸醿?nèi)阻，熱耗而虛，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3]。干姜黃芩黃連人參湯出自《金匱要略》，主治寒熱虛實(shí)錯(cuò)雜之嘔吐。其中干姜味辛善于升發(fā)宣散，人參味甘善于益氣，屬陽(yáng)；黃連、黃芩味苦能降逆泄下，屬陰。將辛溫的干姜、甘溫的人參與苦寒的黃連、黃芩進(jìn)行配伍，“一開(kāi)一降,一補(bǔ)一泄”，與2型糖尿病脾虛胃熱，脾胃升降功能失調(diào)病機(jī)契合，因此干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病，寒溫并用,升降同施，效果顯著[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，干姜中的姜酚有抗氧化、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)胃黏膜、消炎鎮(zhèn)咳等功能[5]；予姜汁給STZ所致的糖尿病大鼠能顯著降低其禁食后血糖水平,并且升高胰島素在體內(nèi)的水平[6]。黃連有止嘔等作用，且能提高胰島素作用的敏感性[7]。黃連中成分槲皮素、黃芩成分中黃芩素和人參中成分山奈酚同屬黃酮類化合物，皆可顯著降低患者的血糖水平[8-9]?；A(chǔ)研究已經(jīng)顯示以上藥物的一些通路靶點(diǎn)，但目前對(duì)于干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的機(jī)理和分子靶點(diǎn)仍尚未完全研究清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可詮釋藥物“成分—靶點(diǎn)—通路”的整體調(diào)節(jié)機(jī)制，能對(duì)藥物與疾病的相關(guān)性進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)研究中藥的多角度作用機(jī)制意義重大[10]。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)是將精選的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集以及原始系列和平臺(tái)記錄存儲(chǔ)在基因表達(dá)綜合庫(kù)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能實(shí)現(xiàn)藥物治療疾病機(jī)理和分子靶點(diǎn)的闡釋。故本研究將通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合GEO分析的方法，探求干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的機(jī)理和分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中分別檢索干姜、黃芩、黃連、人參。傳統(tǒng)中藥多為口服制劑，在人體必然經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝、排泄(ADME)過(guò)程才能與靶器官、靶組織結(jié)合發(fā)揮藥效。而經(jīng)驗(yàn)表明，符合里賓斯基(Lipinski)的類藥五原則的先導(dǎo)藥物因具有較好的ADME性質(zhì)而成為潛在的口服藥[11]。故將口服生物利用度(OB)設(shè)置為≥30%，類藥性(DL)設(shè)置為≥0.18，限定物種為“Homo sapiens”，以得到其活性成分。

1.2 靶點(diǎn)篩選

在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.drugbank.ca/)導(dǎo)入干姜黃芩黃連人參湯的活性成分，獲取對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3 2型糖尿病GEO芯片熱圖與火山圖繪制

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE29221芯片與平臺(tái)數(shù)據(jù)，使用R軟件，設(shè)定 P value<0.005 and |log2(fold change)|>1，繪制熱圖與火山圖，將疾病的差異基因?qū)氲絜xcel表格中。

1.4 治療2型糖尿病分子基因網(wǎng)絡(luò)圖繪制

將干姜黃芩黃連人參湯與2型糖尿病的差異基因取交集后，導(dǎo)入到cytoscape3.7.2中，繪制分子基因網(wǎng)絡(luò)圖，尋找重要的活性分子。

1.5 治療2型糖尿病基因的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將干姜黃芩黃連人參湯與2型糖尿病的差異基因取交集后，導(dǎo)入到cytoscape3.7.2中，使用Bisogenet和CytoNCA，設(shè)置計(jì)算度中心度(DC)>61，中間度中心度BC>600,構(gòu)建其拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，找出重要的候選基因(紅色矩形代表最后篩選出的核心基因)。

1.6 治療2型糖尿病基因GO富集分析

使用R軟件，根據(jù)干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因，進(jìn)行GO富集分析。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度(pvalueCutoff <0.05,qvalueCutoff<0.05)，選取排名靠前的20條GO生物過(guò)程，繪制柱狀圖。

1.7 治療2型糖尿病基因KEGG富集分析

使用R軟件(此分析程序通過(guò)安裝colorspace、stringi、ggplot2、DOSE、clusterProfiler、enrichplot等6個(gè)packages進(jìn)行)，根據(jù)干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因，進(jìn)行KEGG富集分析。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度(pvalueCutoff<0.05,qvalueCutoff <0.05)，選取排名靠前的20條KEGG通路，繪制柱狀圖。

1.8 治療2型糖尿病通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖繪制

將上述KEGG通路導(dǎo)入到cytoscape3.7.2中，根據(jù)degree值大小，顯示通路與基因的富集程度，繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 干姜黃芩黃連人參湯活性成分與靶點(diǎn)

將口服生物利用度(OB)設(shè)置為≥30%，類藥性(DL)設(shè)置為≥0.18，得到與2型糖尿病相關(guān)干姜活性成分19個(gè)，黃芩20個(gè)。黃連7個(gè)，人參3個(gè)。Drugbank顯示成分基因1 078個(gè)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 2型糖尿病GEO芯片熱圖與火山圖繪制

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE29221芯片與平臺(tái)數(shù)據(jù)，共24個(gè)樣本，使用R軟件，繪制熱圖與火山圖，將疾病的差異基因?qū)氲絜xcel表格中。顏色深度代表基因表達(dá)程度，顏色越紅，基因表達(dá)更顯著；顏色更綠，基因表達(dá)更不顯著。見(jiàn)圖2。

2.3 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病分子基因網(wǎng)絡(luò)圖

將干姜黃芩黃連人參湯與2型糖尿病的差異基因取交集后，導(dǎo)入到cytoscape3.7.2中，繪制分子基因網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，分子MOL00098對(duì)應(yīng)最多的靶點(diǎn)，故可認(rèn)為是干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的主要分子。

表1 干姜黃芩黃連人參湯活性成分表Table 1 Active components in GHHR formula

表1 (續(xù))

圖1正常人與2型糖尿病患者差異基因熱圖

Figure1Heat map of differential genes between normal and type 2 diabetic patients

0510-10-586420logFC-log10(P.value)

圖2正常人與2型糖尿病患者差異基因火山圖

Figure2Volcano map of differential genes between normal and type 2 diabetic patients

圖3干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病分子基因網(wǎng)絡(luò)圖

Figure3Molecular gene network diagram of GHHR formula for the treatment of type 2 diabetes

2.4 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖

將干姜黃芩黃連人參湯與2型糖尿病的差異基因取交集后，導(dǎo)入到cytoscape3.7.2中，使用Bisogenet和CytoNCA，設(shè)置計(jì)算度中心度(DC)>61，中間度中心度(BC)>600,構(gòu)建其拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)。從圖4C可以看出，拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)共得到了ERBB2、PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1、AKT1、HSPB1等8個(gè)候選基因。

2.5 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因GO富集分析

使用R軟件，根據(jù)干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因，進(jìn)行GO富集分析。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，選取排名靠前的20條GO生物過(guò)程，繪制柱狀圖。見(jiàn)圖5～圖7。

2.6 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因KEGG富集分析

使用R軟件，根據(jù)干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因，進(jìn)行KEGG富集分析。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，選取排名靠前的20條KEGG通路，繪制柱狀圖。見(jiàn)圖8。

2.7 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖繪制

將上述KEGG通路導(dǎo)入到cytoscape3.7.2中，根據(jù)degree值大小，顯示通路與基因的富集程度，繪制網(wǎng)絡(luò)圖(圖9)?？梢钥闯鰄sa04066是富集基因數(shù)目最多的通路，AKT1、ERBB2、EGF是數(shù)目最多的基因。

圖4 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)Figure 4 Topological network of GHHR formula for the treatment of type 2 diabetes

圖5干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因生物過(guò)程(BP)圖
Figure5Biological process (BP) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

圖6干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因細(xì)胞成分(CC)圖
Figure6Cellular component (CC) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

圖7干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因分子功能(MF)圖
Figure7Molecular function (MF) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

圖8干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病KEGG圖

Figure8KEGG of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

圖9干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖

Figure9Pathway and gene network diagram of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

表2 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病通路
Table2Pathway of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

IDDescriptionGeneRatiohsa04066HIF-1 signaling pathway7/38hsa00330Arginine and proline metabolism4/38hsa01522Endocrine resistance5/38hsa00982Drug metabolism-cytochrome P4504/38hsa01524Platinum drug resistance4/38hsa03320PPAR signaling pathway4/38hsa01521EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance4/38hsa04068FoxO signaling pathway5/38hsa04012ErbB signaling pathway4/38hsa00360Phenylalanine metabolism2/38hsa00061Fatty acid biosynthesis2/38

3 討論

糖尿病的演變主要分為郁、熱、虛、損4個(gè)階段[12]，干姜黃芩黃連人參湯針對(duì)的就是這幾個(gè)階段[13]。因糖尿病的核心病機(jī)為中滿內(nèi)熱、脾虛胃熱，故選用苦寒清胃熱之黃連黃芩，并配以干姜護(hù)中，人參益氣，諸藥相合貫穿治療糖尿病全程。雖然此方在臨床上運(yùn)用較多，但對(duì)其治療2型糖尿病具體的機(jī)理和分子靶點(diǎn)研究現(xiàn)仍然較缺乏，因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合GEO數(shù)據(jù)分析，尋找藥物相關(guān)靶點(diǎn)與作用通路，探討其治療2型糖尿病的分子靶點(diǎn)及機(jī)理，以期進(jìn)一步促進(jìn)臨床運(yùn)用與相關(guān)機(jī)制研究。

干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由49個(gè)化合物和55個(gè)化合物靶點(diǎn)組成。結(jié)果表明(圖3)，大多數(shù)化合物作用于多個(gè)靶點(diǎn)，如槲皮素、黃芩素和山奈酚分別對(duì)32、11、10個(gè)靶點(diǎn)起作用，因此它們很可能是干姜黃芩黃連人參湯的多效活性化合物。槲皮素、黃芩素和山奈酚同屬黃酮類化合物，前槲皮素具有降血糖、降血脂、抗炎、抑制腫瘤等多種作用[14]，對(duì)鏈脲佐菌素糖尿病大鼠降糖作用顯著[15]；黃芩素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[8]，能夠大量降低糖尿病大鼠中的氧自由基，從而改善胰島功能[16]；山奈酚具有抑制線粒體凋亡途徑作用，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)胰島的損害，從而改善血糖水平[9]。在本研究中，槲皮素、黃芩素和山奈酚調(diào)節(jié)大多數(shù)2型糖尿病的靶點(diǎn)。黃芩黃連是本方的主要用藥，針對(duì)2型糖尿病的核心病機(jī)，與該網(wǎng)絡(luò)結(jié)果相符。此外，上述3種藥物成分均具有相對(duì)較高的口服生物利用度，因此，它們可能被認(rèn)定為治療2型糖尿病的代表性化合物。

在對(duì)干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的55個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中，為了獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果，對(duì)DC和BC在內(nèi)的2個(gè)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置并構(gòu)建新的網(wǎng)絡(luò)，并且根據(jù)KEGG通路，結(jié)合degree值大小，尋找與通路相關(guān)的重要基因ERBB2、AKT1、EGF(圖7)，確定了以ERBB2、AKT1、PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1、HSPB1等為主要基因的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)(圖4)。兩者相結(jié)合，得到主要的候選基因?yàn)镋RBB2、AKT1。

表皮生長(zhǎng)因子受體2(ERBB2),是ROCKs和ERK1/2介導(dǎo)糖尿病誘導(dǎo)的血管功能障礙的上游效應(yīng)物。改變涉及ErbB2途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用的潛在策略，已被證明對(duì)治療糖尿病引起的血管并發(fā)癥是有益的[17]。ERBB2存在于 NRG-1/Erb B2中，通過(guò)激活該通路能對(duì)糖尿病患者減輕其心肌的損傷[18]。EGFR / ERBB2信號(hào)傳導(dǎo)是重要的心臟生存途徑，其激活(特別是在糖尿病，局部缺血或用抑制這種級(jí)聯(lián)的藥物治療后)可以顯著改善心臟功能[19]。此外，一項(xiàng)4 420人的隊(duì)列研究表明，ErbB2水平升高與糖尿病的發(fā)病率增加有關(guān)[20]。

AKT1是一種蛋白激酶，其激活能促進(jìn)肝細(xì)胞GK mrRNA表達(dá)，降低血糖[21]。急性胰腺炎發(fā)展過(guò)程中，AKT1在控制腺泡細(xì)胞增殖和腺泡至導(dǎo)管化生(ADM)形成中的關(guān)鍵作用[22]。AKT1是將胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至線粒體并調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體V活性的主要同工型。 線粒體AKT1的激活增強(qiáng)了心肌細(xì)胞中的ATP產(chǎn)生并增加了磷酸肌酸。 該信號(hào)通路的失調(diào)可能損害糖尿病心肌的線粒體生物能[23]。

此外，本文還研究了干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因的GO(BP、CC、MF)和KEGG富集分析。通過(guò)生物過(guò)程(圖5)、細(xì)胞成分(圖6)、分子功能(圖7)、通路(圖8)結(jié)合富集程度顯著性與數(shù)量，篩選出了以response to steroid hormone為主的BP、Steroid hormone receptor activity為主的MF、Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex為主的CC和以HIF-1 為主的信號(hào)通路。

Response to steroid hormones是對(duì)類固醇激素反應(yīng)的生物過(guò)程，類固醇激素分為腎上腺皮質(zhì)激素和性激素兩大類。超生理劑量的類固醇激素，拮抗胰島素的降糖作用，干擾細(xì)胞內(nèi)胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)，減少細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用。且協(xié)同其他內(nèi)源性具有升糖作用的激素，增加腎上腺素受體的表達(dá)，抑制腎小管對(duì)葡萄糖的重吸收，糖代謝出現(xiàn)紊亂，從而出現(xiàn)胰島 β細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[24]。美國(guó)的全國(guó)健康與營(yíng)養(yǎng)調(diào)查中，對(duì)1 461例年齡為≥20歲的男性資料進(jìn)行分析，得出低睪丸激素和高雌二醇可能通過(guò)與成年男性的整體和中樞性肥胖相互作用而增加IR和2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[25]。雌激素綜合征中的雌二醇濃度可能會(huì)干擾胰島素與其受體的結(jié)合，從而產(chǎn)生明顯的胰島素耐藥性[26]。

Steroid hormone receptor activity是指類固醇激素受體活性，而糖皮質(zhì)激素受體是類固醇激素受體的一種，研究顯示肝內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的激活和11beta-HSD1表達(dá)可能有助于db/db小鼠發(fā)生2型糖尿病[27]。胰腺β細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素信號(hào)的長(zhǎng)期增強(qiáng)導(dǎo)致高血糖癥和葡萄糖耐量受損。此作用可能涉及通過(guò)alpha(2)-AR參與胰島素分泌調(diào)節(jié)的信號(hào)通路[28]。

Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶全酶復(fù)合物)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是一組結(jié)構(gòu)相似且相對(duì)分子質(zhì)量為34 000～40 000的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,大多數(shù) CDK在細(xì)胞中,與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，形成活性激酶復(fù)合物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、調(diào)控 DNA 轉(zhuǎn)錄、信使RNA 加工以及神經(jīng)細(xì)胞的分化[29]抑制CDK5過(guò)度激活，可減輕神經(jīng)元凋亡和認(rèn)知缺陷，并有助于緩解糖尿病性腦神經(jīng)毒性[30]。CDK2是將原發(fā)性β細(xì)胞功能障礙與糖尿病患者進(jìn)行性β細(xì)胞質(zhì)量惡化聯(lián)系起來(lái)的重要紐帶。而胰島β細(xì)胞的衰竭是2型糖尿病主要病因[31]。

綜上所述，本研究表明干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病最主要的活性成分為為槲皮素、黃芩素和山奈酚。這些活性成分通過(guò)與ERBB2、AKT1、EGF、 PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1和HSPB1等基因相互作用，通過(guò)esponse to steroid hormone生物過(guò)程、cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex細(xì)胞成分，steroid hormone receptor activity分子功能等作用，單獨(dú)或者共同調(diào)節(jié)HIF-1 signaling pathway等通路，從而對(duì)2型糖尿病發(fā)揮重要治療作用。