傷科藥水的體外抗菌活性研究

安寧，黃瑾妍，江煒，許昕怡，鄧雅方，楊育昆，陳艷芬

(廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

皮膚軟組織感染包括急性皮膚軟組織感染(如癤、膿腫、急性蜂窩組織炎等)和慢性難愈合創(chuàng)面(如慢性潰瘍、燒燙傷、褥瘡等)繼發(fā)感染。目前皮膚感染主要依靠抗菌藥物治療或通過外科手術及時清創(chuàng)引流后再輔助于一定的抗菌藥物治療。因此，抗菌藥物在皮膚感染治療過程中的作用不容置疑，但其毒副作用如過敏反應、二重感染及日益嚴重的細菌耐藥性問題等使其應用受到一定限制[1-3]。近年來有較多文獻報道中藥抗菌的優(yōu)勢[4-5]，中藥抗菌研究不斷被重視，因此開發(fā)中藥資源對抗細菌感染十分重要。傷科藥水是一種基于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和臨床經(jīng)驗創(chuàng)制的醫(yī)院制劑，由黃連、梔子、紫草等中藥組成。其具有抗炎消腫、清熱涼血、活血化瘀等作用，臨床主要用于軟組織及骨骼損傷、跌打損傷，在骨傷科應用廣泛。前期研究證實其有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，且有一定的抗感染作用。本研究通過開展傷科藥水體外抗菌作用的實驗研究，明確其體外抗菌作用特點，為該制劑的臨床應用和進一步研發(fā)奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 實驗菌種

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC 26003)；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureusMRSA3-1007-W1)；糞腸球菌(EnterococcusfaecalisEFA-17001-W1)；鏈球菌(StreptococcusCMCC 32210)；白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa[CMCC(B)10 104])；大腸埃希菌(EscherichiacoliCMCC 44102)均由廣東藥科大學基礎學院保存。

1.2 實驗藥物

傷科藥水，由廣東藥科大學中藥藥理學系提供；黃連(批號20181101)，佛山市中天中藥飲片有限公司產(chǎn)品；莫匹羅星軟膏(國藥準字H10930064)，中美天津史克制藥有限公司。

1.3 實驗試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：3105222)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：3105730)、LB瓊脂培養(yǎng)基(批號：1074511)均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；血清(批號：42G9247K,life technologies)、氯化鈉(批號20171204-2)，廣州化學試劑廠。

1.4 實驗儀器

SW-CJ-IF單人雙面超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；JJ200型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；THZ-98A恒溫振蕩器，BWS-27G精密恒溫水槽；LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；GI54TW全自動立式高壓滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；UV2310Ⅱ雙束紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；H1850R醫(yī)用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

2 方法

2.1 菌液的制備

將裝有各實驗菌的凍存管取出后用37 ℃水浴快速解凍后，吸取少量菌液加入100 mL營養(yǎng)肉湯中，置恒溫振蕩器中120 r/min、37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h。用無菌生理鹽水沖洗菌板，收集菌液，采用比濁法計算菌液濃度，用無菌生理鹽水配制成濃度約為1×107CFU/mL菌液。

2.2 藥物的制備

2.2.1 黃連水煎液 取黃連50 g，加蒸餾水400 mL，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎煮30 min，用紗布過濾后備用。藥渣再加蒸餾水200 mL，二次煎煮30 min，過濾，合并2次濾液，濃縮至100 mL，得黃連水煎液500 mg/mL，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 莫匹羅星水溶液 取莫匹羅星軟膏(含量20 mg/g)6 g，加入無菌蒸餾水至4 mL，溶解，得30 mg/mL的莫匹羅星溶液，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 打孔法測量抑菌圈試驗

以33 g/L質(zhì)量濃度配制營養(yǎng)瓊脂，加入蒸餾水后，高壓滅菌121 ℃ 30 min后得營養(yǎng)瓊脂溶液，在每塊培養(yǎng)皿中倒入25 mL營養(yǎng)瓊脂溶液，自然冷卻得營養(yǎng)瓊脂平板。取配制好的細菌懸液(濃度為1×107CFU/mL)均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基上，每塊瓊脂平板平均分成4份，在每個區(qū)域中心打完孔后用無菌針頭挑出培養(yǎng)基。分別取傷科藥水(690 mg/mL)、黃連水提液(500 mg/mL)、莫匹羅星水溶液(30 mg/mL)、無菌蒸餾水各50 μL，放入對應孔中。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑并記錄。

2.4 瓊脂稀釋法測定最低抑菌濃度

通過前期預實驗初步確定試驗菌MIC在56～35 mg/mL，將滅菌后的傷科藥水與培養(yǎng)基按一定比例混合，使得到的含藥瓊脂濃度分別為55.2 mg/mL、50.6 mg/mL、46 mg/mL、41.4 mg/mL、36.8 mg/mL。吸取5 μL的金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌菌液點種到含藥的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中；吸取5 μL的大腸埃希菌菌液點種于LB培養(yǎng)基；吸取5 μL的鏈球菌菌液點種到含藥的血清培養(yǎng)基中；另取不含藥液的營養(yǎng)瓊脂平板空白對照。將培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察平板長菌情況，以含藥物濃度最低平板有、無細菌生長的濃度為受試菌的抑菌濃度范圍。重復試驗，以藥物最低濃度平板無細菌生長者即為受試菌的最低抑菌濃度(minimun inhibitory concentration，MIC)。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 抑菌試驗

表1結(jié)果顯示，傷科藥水(690 mg/mL)對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌均有抗菌活性，其抑菌圈直徑與無菌蒸餾水組相應的直徑比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但其抗菌效果低于黃連水煎液(500 mg/mL)，略強于莫匹羅星水溶液(30 mg/mL)。其中，傷科藥水作用24 h后對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌的抑菌圈直徑，與黃連水煎液、莫匹羅星水溶液各組的抑菌圈直徑比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑菌圈試驗結(jié)果見圖1。

3.2 MIC測定結(jié)果

表2結(jié)果顯示，傷科藥水質(zhì)量濃度為55.2 mg/mL時，所有供試菌均不能生長。其中，傷科藥水對金黃色葡萄球菌的MIC為36.80 mg/mL、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的MIC為35.27 mg/mL、糞腸球菌的MIC為50.60 mg/mL、鏈球菌的MIC為47.35 mg/mL、銅綠假單胞菌的MIC為46.00 mg/mL、大腸埃希菌的MIC為35.27 mg/mL、白色念珠菌的MIC為52.13 mg/mL。提示傷科藥水對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌的抑制作用較強。

D/mm

與無菌蒸餾水比較：aP<0.05； 與黃連水溶液比較：bP<0.05； 與莫匹羅星水溶液比較：cP<0.05； 與傷科藥水比較：dP<0.05。

A.金黃色葡萄球菌； B.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； C.糞腸球菌； D.鏈球菌； E.銅綠假單胞菌； F.大腸埃希菌； G.白色念珠菌； a.黃連水溶液； b.傷科藥水； c.蒸餾水； d.莫匹羅星水溶液。

圖1抑菌圈試驗結(jié)果圖
Figure1Graph of bacteriostatic circle results

表2 傷科藥水對7種細菌的MICTable 2 MIC of Shangke Yaoshui against 7 kinds of bacteria

4 討論

皮膚軟組織感染是臨床上常見的感染性疾病，治療不當病情易反復或誘發(fā)全身癥狀。為了使研究更貼近臨床，本實驗所采用的病菌均為臨床皮膚感染常見菌[6-8]，體外考察傷科藥水抗皮膚軟組織感染的機制。傷科藥水是一種純中藥醫(yī)院制劑，臨床已證實具有一定的預防和治療皮膚軟組織感染作用，作為中藥制劑不易產(chǎn)生細菌耐藥性，在一定程度上彌補了抗菌藥物的不足。該制劑中黃連清熱燥濕、瀉火解毒，梔子清熱利濕、涼血解毒，紫草清熱解毒、涼血活血，而且現(xiàn)代藥理研究證實這些中藥都有明顯的抗菌作用[9-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)傷科藥水對所有受試菌都有較好的抑制作用，特別是在抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌作用上，效果明顯強于30 mg/mL莫匹羅星水溶液(P<0.05)，說明傷科藥水有較好的體外抗菌作用，對革蘭陽、陰性菌及真菌都有一定抑制作用，這種作用可能是該復方制劑有效防治皮膚軟組織感染的機制之一。金黃色葡萄球菌是引起皮膚軟組織感染的主要病原菌[12-13]，本研究MIC實驗中發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對傷科藥水的敏感性較好，在含傷科藥水36.80 mg/mL的培養(yǎng)基就無法生存，而且傷科藥水對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均有較好的敏感性，可用以治療耐藥菌感染。上述結(jié)果提示傷科藥水作為中藥抗感染藥物應用有一定的前景。研究表明在一些慢性感染過程中和急性感染的后期使用中藥不僅能抗菌消炎，還具有全面的調(diào)理作用[14]。但本研究僅在體外對傷科藥水的抗菌活性進行評價，其在體內(nèi)的抗菌效果還有待于進一步探究。