不同直徑紫蘇梗含量及特征圖譜比較研究

田清清，張雪蘭，張志鵬，梁志毅，方朝纘，魏梅

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實驗室，廣東 佛山 528244)

紫蘇梗為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥莖，秋季果實成熟后采割，呈方柱形，直徑0.5～1.5 cm[1]。紫蘇梗中含有多種化學(xué)成分，包括酚酸類、苯丙酸類、黃酮類、萜類、芳香族、脂肪族等[2]，其中酚酸類成分主要為迷迭香酸、咖啡酸，具有抗過敏、抗氧化、抗感染、抗菌、抗腫瘤、保肝、抗抑郁、降血壓、降血脂等藥理作用[3]。

中藥材商品規(guī)格等級是衡量藥材質(zhì)量優(yōu)良的標(biāo)準(zhǔn)，是影響中藥市場價格的重要因素，對質(zhì)量信息的市場傳遞具有重要作用[4-5]。鄧哲等[6]統(tǒng)計藥材規(guī)格等級與指標(biāo)成分或有效成分的關(guān)系，川芎、羌活、蒼術(shù)、茯苓、味連、天麻、太子參等商品規(guī)格等級與指標(biāo)成分成正相關(guān)； 牡丹皮藥材按長度和粗細(xì)分等級，發(fā)現(xiàn)芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與等級呈負(fù)相關(guān)，而丹皮酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與等級呈正相關(guān)； 白芍、桔梗、遠(yuǎn)志、大黃、西洋參等商品規(guī)格等級與指標(biāo)成分不相關(guān)。僅以指標(biāo)成分或有效成分劃分藥材規(guī)格等級，具有一定的局限性，中藥指紋圖譜或特征圖譜[7-9]具有穩(wěn)定性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，可較為全面反映中藥所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，增加特征圖譜的研究有利于藥材規(guī)格等級的劃分。莖類藥材主要按照加工方法、是否野生、長度、直徑等與大小性狀相關(guān)指標(biāo)劃分等級[10]，因此，本研究建立UPLC法同時測定不同直徑紫蘇梗中咖啡酸和迷迭香酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及特征圖譜，并比較其差異性，為紫蘇梗規(guī)格等級的劃分和藥材質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)； 111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)(浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)； XP26百萬分之一天平(Mettler Toledo)； ME204E萬分之一天平(Mettler Toledo)； JJ2000B型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)。

咖啡酸對照品(批號：110885-201703，純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院)、迷迭香酸對照品(批號：111871-201706，純度90.5%，中國食品藥品檢定研究院)； 液相用甲醇、甲酸、乙腈為色譜級(默克股份有限公司)； 水為超純水(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)； 其余試劑均為分析純。

10批紫蘇梗藥材(編號S1-S10)經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥莖，產(chǎn)地分別來自湖南、廣西、廣東等地。根據(jù)紫蘇梗莖橫切面直徑大小，每批紫蘇梗藥材都劃分為4類，以a、b、c、d分別表示直徑0.1～0.5 cm、直徑0.5～1.0 cm、直徑1.0～1.5 cm、直徑1.5～3.0 cm，10批紫蘇梗藥材根據(jù)不同直徑劃分為40份樣品，分別編號為樣品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脫(0～6 min，10%～18%A； 6～15 min，18%～50%A； 15～15.01 min，50%～10%A； 15.01～20 min，10%A)； 流速：0.4 mL/min； 柱溫：30 ℃，檢測波長：330 nm，進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取咖啡酸對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得到咖啡酸儲備液濃度為157.4 μg/mL，備用； 精密稱取迷迭香酸對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得到迷迭香酸儲備液濃度為350.8 μg/mL，備用。精密移取咖啡酸儲備液2.0 mL及迷迭香酸儲備液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得對照品母液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取紫蘇梗粉末(過三號篩)0.5 g，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇25 mL，加熱回流提取45 min，放冷，離心，取上清液，得到第1次提取液； 藥渣繼續(xù)精密加入80%甲醇25 mL，同法操作，得到第2次提取液，合并2次上清液，加80%甲醇定容至50 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“2.2.1”項下的對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，加甲醇定容至10 mL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。咖啡酸線性回歸方程為：Y=13 676X+209.3，r=1.000 0，結(jié)果表明咖啡酸質(zhì)量濃度在0.31～31.48 μg/mL內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好； 迷迭香酸線性回歸方程為：Y=7 848X+374.5，r=1.000 0，結(jié)果表明咖啡酸質(zhì)量濃度在1.75～175.4 μg/mL內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品母液，按“2.1”項下色譜條件平行進(jìn)樣6次，咖啡酸與迷迭香酸總峰面積的RSD值為0.48%； 以迷迭香酸峰為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積，RSD值均小于2%，結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批紫蘇梗粉末，精密稱定，平行稱定6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算供試品溶液中咖啡酸與迷迭香酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，RSD值為0.91%； 以迷迭香酸峰為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積，各色譜峰相對保留時間的RSD值小于 1%、相對峰面積的RSD值小于2%，結(jié)果表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批次紫蘇梗粉末，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，在0、1、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣測定，測得供試品溶液中咖啡酸與迷迭香酸總峰面積的RSD值為0.42%； 以迷迭香酸峰為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積，實驗結(jié)果表明，12 h內(nèi)各色譜峰相對保留時間的RSD值小于1%、相對峰面積的RSD值小于2%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批次紫蘇梗粉末(咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.157 mg/g，迷迭香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.337 mg/g)，精密稱定，分別精密加入一定量的咖啡酸與迷迭香酸對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液9份，按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，計算咖啡酸與迷迭香酸加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表1。咖啡酸平均加樣回收率為93.73%，RSD值為2.21%，迷迭香酸平均加樣回收率為93.19%，RSD值為2.69%，表明回收率良好。

表1 紫蘇梗的加樣回收率試驗結(jié)果Table 1 Results of recovery test of Perillae Caulis (n=9)

2.3.6 耐用性試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣2 μL，計算咖啡酸與迷迭香酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，選擇Agilent SB C18-1、Agilent SB C18-2、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，RSD值為2.97%； 選擇不同柱溫時，RSD值為0.46%； 選擇不同流速時，RSD值為0.57%，均能達(dá)到系統(tǒng)適用性要求。

2.4 不同直徑紫蘇梗質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.4.1 不同直徑紫蘇梗質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 分別取10批不同直徑紫蘇梗藥材(樣品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算不同直徑紫蘇梗中的咖啡酸和迷迭香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2?？梢?，a規(guī)格樣品的咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于b、c、d規(guī)格，迷迭香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于c、d規(guī)格； b規(guī)格樣品的咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于c、d規(guī)格； c、d規(guī)格中，咖啡酸和迷迭香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

d/cm咖啡酸/(g·mg-1)迷迭香酸/(g·mg-1)0.1～0.50.106±0.007a1.278 ±0.356a0.5～1.00.090±0.009b0.916±0.196ab1.0～1.50.070±0.163c0.572±0.309b1.5～3.00.065±0.125c0.710±0.145b

注：同一行中相同字母表示在0.05水平上差異無統(tǒng)計學(xué)意義；不具或具不同字母表示在0.05水平上差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4.2 主成分分析(PCA) 采用Past 3.0軟件對10批不同直徑紫蘇梗的迷迭香酸、咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，建立PCA模型，繪制的二維得分散點(diǎn)圖見圖1。可見，10批紫蘇梗不同直徑大小共40個樣本分為2類，由于紫蘇梗不同批次間存在一定差異性，除個別樣品b10、c10有交叉，其余樣品直徑<1.0 cm(a和b)聚為一類，直徑>1.0 cm(c和d)聚為一類。

2.5 不同直徑紫蘇梗的特征圖譜

2.5.1 不同直徑紫蘇梗特征圖譜的建立 分別取10批不同直徑紫蘇梗藥材(樣品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10)，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，并記錄色譜圖。不同直徑紫蘇梗的樣品數(shù)據(jù)依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012A)進(jìn)行評價，分別生成四個直徑的UPLC對照圖譜，見圖2。采用相對保留時間分別從40份紫蘇梗樣品中標(biāo)定了15個共有特征峰，通過與對照品比對，確定其中2號峰為咖啡酸、7號峰為迷迭香酸，由于迷迭香酸在各批次不同直徑紫蘇梗中均有出現(xiàn)，分離度良好且峰面積最大，故選擇迷迭香酸為參照峰(S)。

直徑0.1～0.5cm直徑0.5～1.0cm直徑1.0～1.5cm直徑1.5～3.0cm0.040.020.00-0.02-0.04-1.0-0.50.00.51.0

圖1不同直徑紫蘇梗主成分分析(PCA)得分圖

Figure1PCA score plot of main components of Perillae Caulis with different diameters

403020100U/mVt/min1012141602468

R(a).直徑0.1～0.5 cm； R(b).直徑0.5～1.0 cm； R(c).直徑1.0～1.5 cm； R(d).直徑1.5～3.0 cm； A.混合對照品； 2.咖啡酸； 7.迷迭香酸。

圖2不同直徑紫蘇梗藥材共有對照特征圖譜

Figure2Common control UPLC Characteristic chromatograms of Perillae Caulis with different diameters

2.5.2 不同直徑紫蘇梗相似度評價 計算樣品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10與紫蘇梗各直徑范圍對照特征圖譜的相似度，結(jié)果見表3?？梢?，相似度均>0.90，表明相同直徑范圍的不同批次紫蘇梗具有較高的相似度。

2.5.3 方差分析 采用SPSS 20.0軟件對40份樣本從不同直徑進(jìn)行方差分析，并采用字母標(biāo)記法進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表4?？梢姡卣鞣?(咖啡酸)、12在0.1～1.0 cm與1.0～3.0 cm直徑范圍間差異有統(tǒng)計學(xué)意義； 特征峰1、3、10、11、14在0.1～1.0 cm與1.5～3.0 cm直徑范圍間差異有統(tǒng)計學(xué)意義； 特征峰6、7(迷迭香酸)、15在0.1～0.5 cm與1.0～3.0 cm直徑范圍間差異有統(tǒng)計學(xué)意義； 特征峰8在0.5～1.5 cm與1.5～3.0cm直徑范圍間差異有統(tǒng)計學(xué)意義； 特征峰13在0.5～1.0 cm與1.0～3.0 cm直徑范圍間差異有統(tǒng)計學(xué)意義； 特征峰4、5、9在各直徑范圍間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由于特征峰2(咖啡酸)、7(迷迭香酸)在15個特征峰中的占比高達(dá)11%、60%，故總峰在0.1～1.0 cm與1.0～3.0 cm直徑范圍間差異顯著。

2.5.4 不同直徑紫蘇梗特征峰比較 以不同直徑紫蘇梗特征圖譜15個特征峰數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，縱坐標(biāo)為峰面積/取樣量，橫坐標(biāo)為不同直徑規(guī)格，變化規(guī)律見圖3?？梢姡咸K梗特征峰1、2、3、10、11、12、14、15隨直徑的增加呈遞減趨勢； 特征峰4、8、13隨直徑的增加呈先增后減趨勢； 特征峰5隨直徑的增加而增加； 特征峰6、7隨直徑的增加呈先減后增趨勢； 特征峰9的變化與直徑的大小無明顯關(guān)系?？傮w來說，紫蘇梗特征峰隨直徑的增加呈遞減趨勢。

2.5.5 聚類分析(CA) 采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，建立10批紫蘇梗不同直徑大小的聚類分析樹狀圖，結(jié)果見圖4?？梢姡蓪⒉煌睆阶咸K梗共40個樣本聚為2類，由于不同批次間樣品存在一定差異，除去個別樣品(d1、b10、c10)，a與b聚為Ⅰ類，c與d聚為Ⅱ類。綜上所述，根據(jù)10批不同直徑紫蘇梗樣品特征圖譜聚類分析結(jié)果，基本可將紫蘇梗直徑0.1～1.0 cm(a和b)與直徑1.0～3.0 cm(c和d)之間區(qū)分開。

表3 不同直徑紫蘇梗藥材特征圖譜相似度計算Table 3 Similarity calculation of UPLC Characteristic chromatograms of Perillae Caulis with different diameters

表4 不同直徑紫蘇梗藥材方差分析比較結(jié)果Table 4 Comparison of variance analysis of Perillae Caulis with different diameters (峰面積/取樣量)/(mAu·min·g-1)

注：同一行中相同字母表示在0.05水平上差異無統(tǒng)計學(xué)意義；不具或具不同字母表示在0.05水平上差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3不同直徑紫蘇梗特征峰比較
Figure3Comparison of Characteristic peaks of Perillae Caulis with different diameters

Ⅱ類Ⅰ類0510152025c2c8c5d4d10c3c9c6c1b10d9c4d2d3d6c7d8d7d5a6a8a7b6b8b7a9a10b4a1b1d1a3a4a2a5c10b5b9b2b3

圖4不同直徑紫蘇梗聚類分析(CA)樹狀圖

Figure4CA dendrogram of Perillae Caulis with different diameters

3 討論

本研究分別考察了甲醇、80%甲醇、乙醇、稀乙醇、60%丙酮5種提取溶劑的提取效率，結(jié)果表明，當(dāng)80%甲醇作為提取溶劑時，色譜峰分離效果好，響應(yīng)值高； 同時分別考察了超聲處理和回流提取2種提取方式及不同提取時間、提取次數(shù)，結(jié)果表明，回流提取2次，每次45 min時，咖啡酸和迷迭香酸提取較為充分，可作為供試品提取方法。

2015年版《中國藥典》及《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定紫蘇梗直徑應(yīng)為0.5～1.5 cm；上海、天津、重慶、廣西等省、市中藥飲片炮制規(guī)范中也明確規(guī)定了紫蘇梗直徑應(yīng)為0.5～1.5 cm；《陜西省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)(第二冊)》中規(guī)定紫蘇梗直徑為0.2～1.5 cm。中藥材規(guī)格與等級的劃分并非一成不變的，隨著時代的發(fā)展而不斷完善，制定新的規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)，有利于規(guī)范市場，提高藥材質(zhì)量，引導(dǎo)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價，形成良性循環(huán)[4-5,11-12]?！蛾兾髦兴幹尽分惺蛰d紫蘇梗以莖粗為佳，《現(xiàn)代中藥材商品通鑒》中記載以梗嫩為佳。紫蘇梗莖的粗細(xì)、老嫩受采收時間、生態(tài)因子等因素影響，傳統(tǒng)“莖粗”“梗嫩”等感官評價難以作為紫蘇梗藥材流通過程中的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果表明，紫蘇梗直徑0.1～1.0 cm與1.0～3.0 cm無論是指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)還是特征圖譜間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，紫蘇梗直徑大小以1.0 cm為界線，基本可劃分為2種商品規(guī)格等級。因此，結(jié)合現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)，建議以直徑大小為指標(biāo)，將紫蘇梗劃分為2個等級，即直徑0.1～1.0 cm質(zhì)量較優(yōu)為第一等級，1.0～3.0 cm質(zhì)量次之為第二等級。

本文探討了紫蘇梗外觀性狀中直徑大小與內(nèi)在成分之間的關(guān)系，通過測定2個指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及建立特征圖譜，發(fā)現(xiàn)紫蘇梗的直徑大小與咖啡酸、迷迭香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，猜測紫蘇的生產(chǎn)環(huán)境以及采收時間一定程度上影響了咖啡酸、迷迭香酸在莖中的累積。雖然研究結(jié)果表明紫蘇梗直徑較小則質(zhì)量更優(yōu)，但直徑小同時產(chǎn)量也較低，單以直徑小的紫蘇梗入藥不僅容易造成藥材資源的浪費(fèi)，同時影響藥農(nóng)種植的積極性，不利于產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此關(guān)于紫蘇梗直徑大小、采收時間與藥材質(zhì)量三者間的關(guān)系仍需深入研究，以期為紫蘇梗的種植采收提供理論指導(dǎo)。由于紫蘇梗藥材自身結(jié)構(gòu)組織差異，藥效成分分布不同，有的在皮部大量積累，有的卻在木部中大量積累，因此以特征圖譜作為質(zhì)量控制具有一定的科學(xué)性。本研究綜合質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)合特征圖譜，為從紫蘇梗直徑大小角度制定紫蘇梗商品規(guī)格等級的標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。