左旋班布特羅吸入水霧劑的制備及處方優(yōu)化

張睿，周浩鑾，張雪娟，胡軍華，王冠林，陳茜，譚文

(1．廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006； 2．中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

支氣管哮喘是常見的呼吸疾病，具有氣道高反應(yīng)性、炎癥、氣流受限、喘息、氣促、咳嗽等癥狀[1]。班布特羅(Bambuterol，BMB)是一種長效選擇性β2受體激動劑，口服后在體內(nèi)經(jīng)血漿水解為特布他林而發(fā)揮支氣管擴張作用，其半衰期較長(約13 h)[2]，藥效持久(約24 h)，尤其適用于支氣管哮喘的治療[3-5]。班布特羅具有消旋體、右旋體(S型)及左旋體(R型)3種異構(gòu)體。本課題組前期研究表明，左旋班布特羅(R-BMB)相對其他2種異構(gòu)體，具有更強及更持久地氣道舒張作用，同時可有效防止氣道過敏性炎癥的發(fā)生。班布特羅右旋體能增加豚鼠的氣道反應(yīng)，而消旋體及左旋體則無此現(xiàn)象[6-7]。

班布特羅目前臨床給藥途徑通常為口服，具有生物利用度低、用藥量大、副作用高、起效緩慢等缺點。肺部吸入制劑是將藥物以氣溶膠形式遞送至肺部或呼吸道發(fā)揮局部或全身作用的制劑[8]，具有起效快、靶向、無首過效應(yīng)等優(yōu)勢[9]。目前，肺部吸入制劑主要包括吸入粉霧劑、吸入氣霧劑及吸入水霧劑3種常見的制劑形式[10]。相比其他2種吸入制劑，吸入水霧劑具有使用方便、噴霧量可調(diào)整及患者依從性好等優(yōu)點。噴射型霧化裝置相比較超聲霧化及振動篩孔霧化裝置具有霧化粒徑均一等優(yōu)勢，已廣泛使用于臨床治療[11]。

粒徑大小及分布是吸入制劑關(guān)鍵指標，直接影響吸入藥物在肺部的有效沉積率。2015年版《中國藥典》規(guī)定粒徑大小須控制在10 μm以內(nèi)，大多數(shù)小于5 μm[12]。顆粒大于5 μm，沉積于上呼吸道及口咽部。粒徑小于1 μm，則易隨呼氣呼出體外。此外，影響水霧劑粒徑大小及分布因素很多，如溫度、呼吸模式、濕度及表面張力等[11,13]。

基于吸入水霧劑及BMB左旋體的優(yōu)勢，本研究以甘油及丙二醇為輔料，以正交實驗設(shè)計9個處方，測試各處方pH值、滲透壓、表面張力及粒徑大小及分布，并運用方差分析法分析粒徑測試結(jié)果，進而探討丙二醇及甘油對霧化粒徑大小及分布的影響，篩選出肺部有效沉積率較優(yōu)的處方，為R-BMB吸入水霧劑的開發(fā)提供參考。

1 試劑與儀器

R-BMB(東莞市凱法生物醫(yī)藥有限公司,批號：20180705，純度≥99%)；1，2-丙二醇(天津市大茂化學試劑廠，批號：20171008，純度≥99%)；甘油(天津市津東天正精細化學試劑廠，批號：20180601，純度≥99%)；生理鹽水(河南雙鶴華利藥業(yè)有限公司，批號：19081706F)；甲醇(美國Fisher，批號：178507，HPLC級)；乙腈(美國Fisher，批號：178497，HPLC級)；磷酸(成都市科龍化工試劑廠，批號：20130411，純度≥85%)；NaH2PO3(美國Sigma，批號：SLBS6288，純度≥99%)；庚烷磺酸鈉(美國Fisher，批號：1730886，HPLC級)。

Model 5600露點滲透儀(美國WESCOR)；BZY-1全自動表面張力儀(上海平軒科學儀器有限公司)；Seven compact pH離子計(瑞士Mettle Rtoledo)；Waters e2695高效液相色譜；NGI藥用粒子撞擊器(美國Copley)；新帕泰克HELOS激光粒度儀(德國新帕泰克)；Pari?LC sprint噴射霧化器(德國百瑞)；Pari?BOY SX空氣壓縮泵(德國百瑞)。

2 方法

2.1 處方設(shè)計及制備方法

目前，市售BMB劑量為每天20 mg[14]，綜合吸入制劑起效優(yōu)勢及吸入水霧劑霧化時損耗情況，本研究R-BMB劑量設(shè)為2.5 mg/mL，霧化2 min，總量為5 mg。CFDA批準的吸入輔料甘油及丙二醇的限度分別為7.30%和25.00%[15]。在限度范圍內(nèi)選取3個跨度值：甘油0%、1%及2%，丙二醇0%、8%和15%。以此選取正交試驗因素和水平，見表1。正交試驗處方設(shè)計見表2。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

取R-BMB 25 mg置于10 mL棕色容量瓶，按表2加入相應(yīng)的甘油及丙二醇，用生理鹽水定容，得到R-BMB溶液。BMB在水中溶解度為33 mg/mL，所有處方藥物濃度為2.5 mg/mL，不同實驗項目前重新配制溶液。

表2 正交試驗處方設(shè)計Table 2 Prescription design of orthogonal test

2.2 HPLC法測定R-BMB的質(zhì)量分數(shù)[16]

2.2.1R-BMB對照品溶液的制備 精密稱取R-BMB原料藥25 mg，放于10 mL棕色容量瓶中，用流動相定容，配制成2.5 mg/mL的工作液，將工作液逐級稀釋，得到500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906、1.953、0.488 μg/mL10個等梯度的對照品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：220 nm；流動相：磷酸鹽緩沖液-甲醇-乙腈(體積比500∶309∶100，加入0.12%的庚烷磺酸鈉)。R-BMB的HPLC色譜圖見圖1?？梢姡琑-BMB保留時間為6.2 min，主峰分離良好，陰性溶液色譜圖對主峰測試無影響。

0.250.200.150.100.050.00AU2.52.01.51.00.50.0?10-3AB02468100246810t/mint/min

A.R-BMB溶液； B.陰性溶液。

圖1R-BMB及陰性溶液HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatograms ofR-BMB and reference solution

2.3 理化性質(zhì)測試

2.4 粒徑測試

2.4.2 碰撞法測定粒徑 根據(jù)2015年版《中國藥典》吸入制劑微細粒子空氣動力學特性測定法[12]，采用NGI進行空氣動力學粒徑測試，將NGI各收集盤的含量計算結(jié)果通過軟件(CITDAS，copley_V310，美國Copley)分析，可得到9個處方霧化吸入溶液的質(zhì)量中位直徑(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和細顆粒百分比(fine particle fraction，F(xiàn)PF)參數(shù)。每個處方重復測試3次。

2.5 正交試驗結(jié)果評價方法

肺部有效沉積率是吸入制劑的關(guān)鍵指標，而d0.5及MMAD直接決定肺部有效沉積率。正交試驗中方差分析能精確估計各因素的影響程度，應(yīng)用廣泛。本研究選用方差分析法對試驗結(jié)果中d0.5及MMAD進行分析，計算得出F值，篩選R-BMB吸入水霧劑中的丙二醇及甘油最優(yōu)配比[20]。

3 結(jié)果

3.1 理化性質(zhì)測定結(jié)果

9個處方的pH值、滲透壓和表面張力測定結(jié)果見表3。

表3 9個處方的理化性質(zhì)測定結(jié)果Table 3 Physical and chemical properties of nine prescriptions

從表3可見：在丙二醇等量的條件下，隨著甘油的增加或減少，pH值沒有明顯變化，可知甘油對pH值的影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在甘油等量的條件下，隨著丙二醇用量的增加，pH值有降低趨勢，可知丙二醇對pH值的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；所有處方pH值均在3～8.5范圍內(nèi)，符合《中國藥典》規(guī)定[12]。在丙二醇等量的條件下，隨著甘油及丙二醇量的增加，滲透壓值有升高趨勢，可知甘油及丙二醇對滲透壓的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在丙二醇等量的條件下，隨著甘油的增加或減少，表面張力值均沒有明顯變化，可知甘油對表面張力的影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在甘油等量的條件下，隨著丙二醇用量的減少表面張力有升高趨勢，可知丙二醇對表面張力的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.2 粒徑測試

3.2.1 激光衍射法測試粒徑結(jié)果 從表4可見，R-BMB霧化吸入溶液9個處方的粒徑分布皆符合吸入水霧劑的處方要求，其中處方F3、F4、F6、F7及F8測試結(jié)果d0.5在2.553 μm左右[11]，具有較好的肺部沉積率；且隨著丙二醇用量的增加，d0.5有減小的趨勢；當丙二醇為0%和8%時，隨著甘油的增加d0.5同樣有減小的趨勢，而丙二醇為15%時，隨著甘油的增加d0.5有增加的趨勢。所有處方Span值均較小，表明此水霧劑粒徑分布相對均一。

表4 9個處方的激光衍射法測定粒徑結(jié)果Table 4 Determination of particle size by laser diffraction in nine prescriptions

3.2.2 碰撞法測定粒徑結(jié)果 由從表5可見，所有處方的FPF值和MMAD值皆滿足吸入水霧劑藥物顆粒粒徑要求[12]，表明其肺部有效沉積率較高。處方F3、F5及F8的MMAD小于4 μm，F(xiàn)PF在60%以上。當甘油的量為0%和2%時，隨著丙二醇量的增加，MMAD有減小的趨勢，而甘油的量為1%時，隨著丙二醇量的增加，MMAD有增加的趨勢。當丙二醇為0%和8%時，隨著甘油量的增加，MMAD先減小后增加，而當丙二醇為15%時，隨著甘油量的增加，MMAD先增加后減小。

從圖2各處方藥物在NGI各盤的質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果可見，F(xiàn)3、F4、F6、F7及F8在Stage4～Stage6級段(其截留粒徑1.36～3.30 μm)[11]藥物沉積較多，表明隨著甘油和丙二醇的加入，有助于藥物的肺部遞送及沉積，丙二醇的影響程度較大。

3.3 正交試驗分析結(jié)果

采用L9(34)正交表，方差分析法分析d0.5及MMAD數(shù)值，結(jié)果見表6及表7。

表5 9個處方的FPF和MMAD測定結(jié)果Table 5 FPF and MMAD of nine prescriptions

4530150質(zhì)量分數(shù)/%F1F2F3F4F5F6F7F8F9Stage1Stag2Stage3Stage4Stage5Stage6Stage7裝置喉MOC

表7 d0.5及MMAD方差分析表Table 7 Variance analysis of d0.5 and MMAD

在1～5 μm范圍內(nèi)，d0.5及MMAD越小，沉積效率越高[11]。表6的d0.5方差分析結(jié)果表明最優(yōu)處方為A3B3(F8)，即2%甘油和15%丙二醇；而MMAD方差分析結(jié)果表明最優(yōu)處方為A2B3(F4)，即1%甘油和15%丙二醇。方差分析不僅可以看因素影響的主次，同時可以看出其影響是否顯著，從2個指標分析結(jié)果的F值可見，丙二醇對試驗的影響明顯大于甘油，但沒有達到顯著程度。

將處方F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7及F9與處方F8(2%甘油和15%丙二醇)的d0.5及MMAD進行處方間單獨顯著性分析，結(jié)果見表8。可見，F(xiàn)8處方與其余處方的d0.5及MMAD的差異隨著甘油及丙二醇的添加，有由極顯著性到無顯著性的趨勢。

注：以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3.4 驗證試驗

為了驗證上述方差分析得出輔料配比的可行性，以處方4(1%甘油和15%丙二醇)制備3批樣品，并進行吸入水霧劑指標驗證，結(jié)果見表9?？梢姡幏礁黜椫笜司稀吨袊幍洹芬?。肺部有效遞送效率是吸入制劑的關(guān)鍵指標。在d0.5和MMAD方面，由表6可知F4處方較其他處方有較低的數(shù)值，表明它有更高的肺部有效遞送效率。

表9 驗證試驗結(jié)果Table 9 Verification of experimental results

4 討論

本文結(jié)果顯示，甘油對pH值無顯著影響，而丙二醇則有極顯著影響，可能是由于甘油是三元醇，丙二醇是二元醇，在自身及促進溶液中離子電離程度不同，溶液中的離子主要是R-BMB離子、氫離子、氫氧根離子及甘油和丙二醇電離的離子，處方中丙二醇加入量跨度較大，可能引起了R-BMB、甘油、水及其本身的電離動態(tài)平衡，促進了氫離子的產(chǎn)生，從而降低了溶液的pH值。滲透壓與溶液濃度有關(guān)，甘油與丙二醇的添加均會改變?nèi)芤簼舛?，所以二者對滲透壓均有極顯著影響。對于表面張力而言，甘油對其影響不顯著，而丙二醇則有顯著影響，可能是因為丙二醇是常見的表面活性劑，也可能跟甘油和丙二醇添加量有關(guān)。

綜合pH、滲透壓、表面張力與d0.5及MMAD結(jié)果，總體上隨著甘油和丙二醇的增加，d0.5與MMAD有下降趨勢，從而使得藥物有較好的肺部沉積率。激光衍射法測試粒徑結(jié)果，當丙二醇的量為不同值時，隨著甘油的增加d0.5有減小或者增加的趨勢。碰撞法測試粒徑結(jié)果，當甘油的量為不同值時，隨著丙二醇量的增加，MMAD有減小或增加的趨勢。當丙二醇的量為不同值時，隨著甘油量的增加，MMAD先減小后增加或者先增加后減小。此現(xiàn)象說明不同原理的粒徑測試方法之間存在一定的差異性，同時溶液性質(zhì)能顯著影響吸入水霧劑的粒徑大小，從而影響其肺部有效沉積率。此結(jié)果與McCallion等[13]研究結(jié)果類似。從本研究結(jié)果來看，甘油及丙二醇加入量的不同能使pH、滲透壓及表面張力發(fā)生改變，從而影響吸入水霧劑的粒徑大小及分布，最終影響肺部有效沉積率。但溶液體系復雜，理化性質(zhì)眾多，這也是粒徑大小沒有和甘油及丙二醇加入的量成線性的原因。除pH、滲透壓及表面張力3種理化性質(zhì)以外的其他因素也需要考慮，本團隊后續(xù)將進一步研究。

粒徑大小及分布影響因素較多，除藥物溶液本身理化性質(zhì)以外，霧化環(huán)境[11]等也是重要影響因素。本研究正交實驗方差分析結(jié)果表明，處方A3B3(2%甘油和15%丙二醇)和A2B3(1%甘油和15%丙二醇)為較優(yōu)處方，由于碰撞法為吸入制劑粒徑測試的“金標法”[11]，且根據(jù)輔料最低用量原則，推薦處方4(1%甘油和15%丙二醇)為R-BMB吸入水霧劑處方。從表7方差分析結(jié)果可見，甘油及丙二醇均無表現(xiàn)出顯著影響，但表8處方間單獨顯著性分析結(jié)果顯示隨著甘油及丙二醇的加入，影響呈顯著性上升趨勢，其中丙二醇更為明顯。這可能與輔料選用的添加量較少有關(guān)，此外，甘油和丙二醇之間的相互干擾也可能引發(fā)這種差異。

吸入水霧劑霧化器主要有噴射霧化器、超聲霧化器及振動篩孔霧化器3種類型，而噴射型霧化器較其他2種具有使用簡便、霧化出的氣溶膠粒徑大小均一穩(wěn)定、肺部有效沉積率高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)院和家庭[11]。因此，本研究中使用的霧化器為噴射型霧化器，但吸入制劑的霧化粒徑大小除與處方工藝有關(guān)之外，還在很大程度上取決于霧化裝置，本研究局限于噴射型霧化器，后續(xù)研究需增加對不同類型裝置影響的考察。