姜黃素藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)與抗卵巢癌藥效作用模擬分析

謝海源，黃 巍，唐亞平，李 清，陸青玉，何美英，范 蓉

廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530200

中藥姜黃形似姜、色黃，性溫，味辛苦，歸肝、脾經(jīng)，具有行氣散滯、活血化瘀之功效，主要含有姜黃素類成分、揮發(fā)油類成分等，現(xiàn)代研究表明姜黃具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、抗病毒等多種藥理活性[1]。姜黃素是中藥姜黃中最重要的抗癌物質(zhì)之一，是從姜黃根莖中提取得到的黃色色素，其母核結(jié)構(gòu)為二苯基庚烴，能靶向多個(gè)腫瘤基因蛋白、多條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，有望治療癌癥等惡性疾病[2]。姜黃素抗卵巢癌效果顯著，已引起國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注，Pang等[3]利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)姜黃素能明顯抑制卵巢癌的細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前多項(xiàng)針對(duì)姜黃素類化合物的抗腫瘤研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，因此靶向姜黃素的制藥研究，具有良好的應(yīng)用前景和可行性。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明卵巢癌等惡性腫瘤疾病，是由多種遺傳、非遺傳因素，多個(gè)靶點(diǎn)、通路引起的復(fù)雜性疾病，而中藥活性成分往往具有多靶點(diǎn)、多功效的藥理作用特點(diǎn)，傳統(tǒng)的“一個(gè)靶點(diǎn)，一種疾病，一個(gè)藥物”的研究模式，已很難系統(tǒng)、整體地闡明中藥活性成分對(duì)復(fù)雜疾病的藥理作用機(jī)制[4]。隨著計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和分析等新理念的相繼提出，為中藥及其活性成分研究帶來了新的技術(shù)與方法，其系統(tǒng)性、整體性的研究理念與中藥活性成分多靶點(diǎn)、多途徑、協(xié)同作用等特點(diǎn)不謀而合。本研究基于計(jì)算機(jī)模擬分析的研究思路與方法，從系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)層面研究姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，規(guī)避傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究的盲目、不系統(tǒng)、耗費(fèi)高、耗時(shí)長(zhǎng)等弊端，有助于揭示姜黃素分子生物學(xué)藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 活性成分選取

在Chemicalbook數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.chemicalbook.com)獲取姜黃素三維結(jié)構(gòu)等信息，并利用ChemBio3D Ultra 14.0軟件的MM2下的Minimize Energy模塊將姜黃素結(jié)構(gòu)能量最小化。

1.2 藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)

用SwissADME服務(wù)器分析姜黃素原型的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，探討姜黃素的成藥性、血腦屏障透過率、胃腸吸收、以及肝藥酶抑制等藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.3 姜黃素靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

本研究通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和分子構(gòu)效關(guān)系找靶兩種策略，挖掘姜黃素潛在的作用靶點(diǎn)。首先，將姜黃素導(dǎo)入STITCH化合物-靶蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://stitch.embl.de/)，設(shè)置參數(shù)為“highest confidence = 0.9”高置信度，利用數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘的方法尋找姜黃素潛在靶點(diǎn)。其次，利用SwissTarget Prediction靶點(diǎn)搜尋服務(wù)器(http://www.swisstargetprediction.ch/)，基于姜黃素分子結(jié)構(gòu)，反向?qū)ふ移錆撛谒幮О悬c(diǎn)。最后，將兩種方法挖掘的得到的靶點(diǎn)整合，建立姜黃素潛在靶點(diǎn)集合。

1.4 卵巢癌相關(guān)基因集合的構(gòu)建

運(yùn)用GeneCards、DisGeNET、OpenTargets數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲取卵巢癌相關(guān)基因。將以上數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的卵巢癌基因按照相關(guān)程度打分score值從高到低排列，依次取評(píng)分高的前100個(gè)基因，篩除重復(fù)后合并，構(gòu)建卵巢癌基因集合。

1.5 姜黃素靶點(diǎn)-卵巢癌基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建“姜黃素靶點(diǎn)-卵巢癌基因”相互作用網(wǎng)絡(luò)，定義來源為“Homo sapiens”(智人)進(jìn)行分析，最低相互作用閥值設(shè)為“medium confidence = 0.4”中等。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)度值(degree)、介數(shù)(betweenness)、最短路徑(closeness)中心性是判斷一個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的三個(gè)主要拓?fù)鋮?shù)，度值、介數(shù)、最短路徑越大，節(jié)點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)就越重要。本研究以度值、介數(shù)、最短路徑的“中位數(shù)”為臨界值，篩選出臨界值以上的抗卵巢癌靶點(diǎn)，確定為姜黃素抗卵巢關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)行下一步研究。

1.6 KEGG通路研究

利用DAVID v 6.8服務(wù)器對(duì)姜黃素關(guān)鍵抗卵巢癌靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，篩選出P-value<0.05的癌癥通路，研究其抗卵巢癌通路與作用途徑。

1.7 靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

用分子對(duì)接服務(wù)器SystemsDock和分子對(duì)接軟件Autodock vina驗(yàn)證姜黃素與主要抗卵巢癌靶點(diǎn)的親和力大小。SystemsDock是基于Autodock vina分子對(duì)接算法的一款高精度對(duì)接服務(wù)器，運(yùn)算速度快、準(zhǔn)確率高。對(duì)接打分(docking score)值代表了配體與受體的親和力情況，其中docking score<4.25說明分子和靶標(biāo)親和力不強(qiáng)，docking score>4.25說明分子和靶標(biāo)有中等親和力，docking score>5說明分子和靶標(biāo)有較強(qiáng)的親和力，docking score>7說明分子和靶標(biāo)有強(qiáng)烈的親和力。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)

將姜黃素SMILES代碼導(dǎo)入SwissADME服務(wù)器，分析了姜黃素原型的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如表1、圖2所示，姜黃素基本符合Lipinski類藥五原則，具有較好的成藥性和一定的胃腸吸收性，但不能通過血腦屏障，且非P-糖蛋白底物。姜黃素對(duì)肝藥酶CYP2C9、CYP3A4具有一定抑制性，對(duì)CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6未表現(xiàn)抑制活性。

續(xù)表1(Continued Tab.1)

類別Category姜黃素參數(shù)Curcuminparameter標(biāo)準(zhǔn)值Standardparameter血腦屏障Blood-brainbarrierpermeant否無胃腸吸收Gastrointestinalabsorption高無P-糖蛋白底物P-glycoproteinsubstrate否無極性TopologicalpolarsurfaceareaTPSA=93.06?220?2

圖1 姜黃素的藥代參數(shù)

圖2 姜黃素的潛在靶點(diǎn)

2.2 姜黃素靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

如圖2所示，利用SWISS服務(wù)器和STITCH服務(wù)器分別預(yù)測(cè)得到14個(gè)和31個(gè)姜黃素潛在靶點(diǎn)，其中重復(fù)靶點(diǎn)有2個(gè)。姜黃素潛在靶點(diǎn)種類廣泛，包括TP53原癌基因、CASP3凋亡基因、HIF1A、AR等細(xì)胞因子和激素等，表現(xiàn)出明顯的多靶點(diǎn)效應(yīng)。

2.3 姜黃素靶點(diǎn)-卵巢癌基因網(wǎng)絡(luò)

以“ovarian carcinoma”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards、DisGeNET和OpenTargets數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與卵巢癌相關(guān)的靶基因，提取三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)分?jǐn)?shù)前100的靶基因并篩除重復(fù)，得到174個(gè)相關(guān)的卵巢癌基因。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將43個(gè)姜黃素靶點(diǎn)與174個(gè)卵巢癌基因構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。如圖3所示，姜黃素靶點(diǎn)與卵巢癌基因能構(gòu)成了復(fù)雜關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、含3 753條關(guān)聯(lián)連線，涉及到基因融合、基因共表達(dá)等多種關(guān)聯(lián)關(guān)系。

圖3 姜黃素靶點(diǎn)-卵巢癌基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

表2給出了姜黃素的主要抗卵巢癌癌靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)?？梢钥吹?，網(wǎng)絡(luò)的度值中數(shù)為42、介數(shù)中數(shù)為2.47×10-3、最短路徑中數(shù)為5.29×10-1。如表2所示，共得到17個(gè)姜黃素靶點(diǎn)，度值、介數(shù)、最短路徑均大于中數(shù)“臨界值”，以其為姜黃素抗卵巢癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)行下一步研究。

表2 姜黃素的主要抗卵巢癌癌靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

靶點(diǎn)Target度值Degree介數(shù)Betweenness最短路徑ClosenessPTGS2634.47×10-35.74×10-1MMP9693.53×10-35.74×10-1MMP2643.41×10-35.68×10-1CCNE1502.47×10-35.55×10-1

2.4 KEGG通路富集

表3和圖4給出了姜黃素17個(gè)抗卵巢癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集結(jié)果，可以看到6大類16條與癌癥密切相關(guān)的KEGG通路(P-value<0.01)被篩選出。具體包括：①腫瘤血管生成相關(guān)的缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號(hào)通路；②腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的黏著斑(focal adhesion)、黏著斑連接(adherens junction)通路；③腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的p53信號(hào)通路、凋亡通路；④腫瘤免疫相關(guān)的腫瘤壞死因子(TNF)通路；⑤雌激素通路；⑥腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的Cell cycle、PI3K/Akt、Ras、MAPK、ErbB、Jak-STAT、Wnt、FoxO、Rap1等通路。富集結(jié)果顯示，姜黃素可能通過調(diào)節(jié)以上KEGG通路，發(fā)揮抗卵巢癌的作用。

表3 KEGG通路

圖4 KEGG信號(hào)通路富集

2.5 靶點(diǎn)驗(yàn)證

利用SystemsDock服務(wù)器對(duì)姜黃素和17個(gè)關(guān)鍵抗卵巢癌靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接。從表4可知，姜黃素與17個(gè)抗卵巢癌靶標(biāo)分子的對(duì)接分?jǐn)?shù)均大于4.25，姜黃素與EGFR、TP53、AKT1、ERBB2、CASP3、MTOR、STAT3、HIF1A、MMP2、PTGS2等17個(gè)靶標(biāo)均屬于有效結(jié)核，良好的親和活性也體現(xiàn)了本研究的可靠性。就其中第一個(gè)靶點(diǎn)EGFR為例，圖5給出了EGFR抑制劑W2R和姜黃素分子對(duì)接對(duì)比，從圖可以看出姜黃素與EGFR抑制劑W2R作用情況基本類似，能有效結(jié)合與EGFR的活性中心，與Leu718、Phe723、Val726、Ala743、Lys745、Met766、Thr790、Met793、Leu844、Thr854、Asp855、Phe856、Gly857等關(guān)鍵的氨基酸殘基相互作用，從而抑制EGFR活性達(dá)到抗腫瘤的藥理效果。

表4 姜黃素分子對(duì)接結(jié)果

續(xù)表4(Continued Tab.4)

核心靶標(biāo)KeytargetPDB編號(hào)PDBID對(duì)接打分DockingscoreCASP33GJQ5.126??STAT34ZIA8.212???MTOR4JSV4.716?IGF1R2OJ94.479?HIF1A1H2M4.788?AR2PIX7.876???PTGS25F196.269??MMP95TH66.538??MMP21RTG6.112??CCNE15L2W6.378??

注：***非常強(qiáng)相互作用；**強(qiáng)相互作用；*中等相互作用。

Note:***Very strong interaction;**Strong interaction;*Medium interaction.

圖5 EGFR抑制劑W2R和姜黃素分子對(duì)接對(duì)比

3 討論

卵巢癌的病死率位于婦科腫瘤疾病首位，其發(fā)病率位于女性生殖系統(tǒng)腫瘤第三位[5]，目前國(guó)際公認(rèn)的卵巢癌一線化療方案是TC(紫杉醇+卡鉑)和TP(紫杉醇+順鉑)方案。由于現(xiàn)有方案療效有限，化療藥物存在惡心嘔吐、骨髓抑制、肝腎損害等毒副作用，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后和生存質(zhì)量[6]，因此開發(fā)研究新一代高效低毒抗腫瘤藥物勢(shì)在必行。

中藥小分子活性物質(zhì)——姜黃素，能從多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，已經(jīng)得到許多實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，研究中藥小分子的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和肝藥酶影響，有助于明確中藥小分子與其他臨床藥物的相互作用和耐藥性等，對(duì)提高臨床用藥有效性和安全性大有裨益。研究[7]表明姜黃素口服不易吸收，生物利用度低，但對(duì)其是否可能通過P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、是否影響肝藥酶的活性不甚了解，而且對(duì)其生物利用度等缺乏具體的數(shù)據(jù)可考。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素基本符合Lipinski的類藥五原則，具有較好的成藥性和一定的胃腸吸收性，但不能通過血腦屏障，且非P-糖蛋白底物。另外，姜黃素對(duì)肝藥酶CYP2C9、CYP3A4具有一定抑制性，對(duì)CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6不具有抑制性。Zhang等[8]建立血腦脊液屏障模型，發(fā)現(xiàn)姜黃素為血腦脊液屏障低滲透性藥物，通過性較差；Hou等[9]發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制CYP3A4的表達(dá)；Volak等[10]發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)CYP1A2、CYP2D6等肝藥酶的影響較小，這些均與本研究結(jié)果一致?？梢?，用計(jì)算機(jī)模擬來分析中藥小分子藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，真實(shí)性良好、為后續(xù)合理開發(fā)姜黃素生物藥劑提供了參考。

模擬分析表明，姜黃素能直接、間接的調(diào)控TP53、CASP3、EGFR、ERBB2、AKT1、MTOR、STAT3、MMP2、MMP9、HIF1A、PTGS2、CCND1等17個(gè)卵巢癌相關(guān)基因，實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)抗腫瘤效果。Yuan等[11]通過Western blot法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞p53(TP53)和caspase-3(CASP3)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)姜黃素作用48 h后能明顯提高腫瘤細(xì)胞p53和活化caspase-3含量，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。EGFR與ERBB2均為表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，其異常激活能促進(jìn)SKOV3卵巢癌細(xì)胞的惡性增殖[12]，Yang等[13]發(fā)現(xiàn)姜黃素能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與下調(diào)EGFR表達(dá)相關(guān)。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)姜黃素能降低Akt、mTOR(MTOR)蛋白表達(dá)水平，抑制T2卵巢癌細(xì)胞株增殖，其8 h的IC50為21.2μmol/L。Duan等[15]通過Western blot方法發(fā)現(xiàn)姜黃素衍生物能抑制STAT3及基質(zhì)蛋白酶MMP2、MMP9的表達(dá)，劑量依賴性的抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。HIF-1α是治療惡性腫瘤的一個(gè)新的靶點(diǎn)，Wan等[16]利用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制人胰腺癌HIF-1α發(fā)揮抗腫瘤作用，提示姜黃素可能通過調(diào)控HIF1A發(fā)揮相似的抗卵巢癌作用。Pan等[17]報(bào)道了姜黃素能調(diào)控環(huán)氧酶2(PTGS2)、G1/S-特異性周期蛋白Cyclin D1(CCND1)、EGFR等抑制卵巢癌的增殖發(fā)展。總之，本研究通過關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)篩選出的姜黃素關(guān)鍵抗卵巢癌靶點(diǎn)與當(dāng)前許多研究相互佐證，說明姜黃素能通過調(diào)控以上“多靶點(diǎn)”來實(shí)現(xiàn)抗卵巢癌的作用。

對(duì)姜黃素17個(gè)核心抗卵巢癌靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路富集研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素能調(diào)控腫瘤血管生成、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤免疫、雌激素通路、腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)展等6大類16條信號(hào)通路，發(fā)揮多途徑抗卵巢癌的藥理作用。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗腫瘤血管的作用，主要是通過HIF-1α、VEGF等途徑實(shí)現(xiàn)的。Liu等[19]研究表明姜黃素能通過調(diào)節(jié)黏著斑蛋白含量，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用。說明姜黃素具有抗腫瘤血管生成、抗浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用，且與本研究富集的HIF-1α、黏著斑(focal adhesion)、黏著斑連接(adherens junction)通路相符。Fu等[20]發(fā)現(xiàn)姜黃素能通過p53通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡、擴(kuò)散；Lin等[21]通過實(shí)驗(yàn)表明姜黃素能降低TNF-α等免疫因子含量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；與本研究的富集結(jié)果相似，表明姜黃素能通過調(diào)控p53通路、調(diào)控免疫因子TNF-α，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素能調(diào)控Cell cycle、PI3K/Akt、Ras、Rap1、MAPK、ErbB、Jak-STAT、Wnt、FoxO等與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號(hào)通路。Wang等[3]綜述報(bào)道了姜黃素能靶向p53、Ras、PI3K、AKT等信號(hào)通路，具有良好的抗癌效果、且?guī)缀鯚o不良反應(yīng)。Wang等[22]通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)姜黃素主要是通過調(diào)控MAPK通路，抑制卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。Liu等[23]利用熒光素酶檢測(cè)和免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)姜黃素有很強(qiáng)的STAT3信號(hào)通路抑制作用，能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。Zhu等[24]發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路能介導(dǎo)姜黃素抑制顯著腫瘤細(xì)胞的增殖分化，臨床治療腫瘤效果確切。Zhang等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素不僅能抑制Akt信號(hào)通路活化，還對(duì)Akt下游的FoxO信號(hào)通路有明顯的抑制作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞活性。綜上，姜黃素能通過多條信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖發(fā)展。為明確本研究靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，在SystemsDock服務(wù)器對(duì)17個(gè)關(guān)鍵抗卵巢癌靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)姜黃素與17個(gè)靶標(biāo)均有較好的親和力，說明本研究靶標(biāo)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠，也進(jìn)一步反應(yīng)了本研究關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、KEGG通路富集以及最后結(jié)果結(jié)論的可靠性。

綜上，本研究通過計(jì)算機(jī)模擬分析技術(shù)，研究了姜黃素的基本藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)其成藥性良好；姜黃素能作用于17個(gè)核心抗卵巢癌靶標(biāo)、調(diào)控6大類16條抗卵巢癌信號(hào)通路，發(fā)揮多途徑抗卵巢癌藥理作用，具有“多靶點(diǎn)-多通路-多途徑”抑制卵巢癌的的良好藥理作用。本研究為后續(xù)姜黃素藥理作用機(jī)制的探討以及新型藥劑的開發(fā)提供了參考。