櫻桃核的主要成分及水溶性多糖的體外抗氧化測(cè)定

胡曉倩，吳永祥，李長(zhǎng)江，李德寶，何玲玲，黃蘭蘭

1黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院；2黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，黃山 245041

櫻桃屬于漿果，果實(shí)皮薄肉嫩，柔軟多汁，加之采收季節(jié)氣溫較高，耐貯性差，所以市場(chǎng)供應(yīng)期極短[1]。為解決這一問(wèn)題，目前最常見最普通的就是把櫻桃加工成櫻桃汁、櫻桃酒、櫻桃醋、櫻桃果脯等深加工產(chǎn)品，但是櫻桃的核，作為副產(chǎn)物卻在加工過(guò)程中被丟棄成為廢棄物[2]。

櫻桃的可食部分(果肉)具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]，但櫻桃核基本成分的研究鮮有報(bào)道。Guo等[4]研究發(fā)現(xiàn)有些水果的非肉質(zhì)部分的抗氧化活性高于肉質(zhì)部分。古書記載了櫻桃核的藥用價(jià)值。近年來(lái)，學(xué)者對(duì)櫻桃核中類黃酮的提取及其功能研究較多[5]，另外，Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)櫻桃核的脂溶性成分具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的抗氧化功能；Guo等[7]研究發(fā)現(xiàn)櫻桃核水提取物具有顯著的抗疲勞、耐缺氧及鎮(zhèn)痛作用。多糖是有機(jī)體必須的營(yíng)養(yǎng)和功能物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、降血糖、抗腫瘤等生物活性[8]，但目前對(duì)櫻桃核中生物活性成分多糖的提取及功能的研究報(bào)道卻甚少。

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定了櫻桃核中灰分、蛋白質(zhì)、總糖、脂質(zhì)和Vc等功能成分的含量，采用水溶醇沉方法從櫻桃核中提取水溶性多糖，以Vc作為對(duì)照，評(píng)價(jià)其體外抗氧化功效。本研究旨為闡明櫻桃核的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其多糖的功效，為櫻桃加工的副產(chǎn)物櫻桃核“變廢為寶”的開發(fā)利用提供理論參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料

美早櫻桃購(gòu)于黃山市大潤(rùn)發(fā)超市。將櫻桃果肉剝離，核洗凈后粉碎過(guò)100目篩待用。

1.1.2 試劑

鹽酸、濃硫酸、抗壞血酸、草酸、2，4-二硝基苯肼、硫脲、活性炭、氫氧化鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、乙醚、丙酮、酒石酸鉀鈉、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、水楊酸、過(guò)硫酸鉀、沒(méi)食子酸(鄰苯三酚)、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸緩沖液(0.2 M，pH 6.6)、氯化鐵、三氯乙酸(TCA)、鐵氰化鉀、乙醇、甲醇、維生素C(Vc)等，均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

粉碎機(jī)(浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠)、100目篩(永康市群鑫金屬制品廠)、YP3001N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、LPCD-E3000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)、FL-1電子萬(wàn)用爐(北京市永光醫(yī)療儀器有限公司)、HH-S恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器有限公司)、UV754紫外可見分光光度計(jì)(上海奧譜勒儀器有限公司)、Microfuge 20R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)中國(guó)有限公司)、索氏提取器(上海析達(dá)儀器有限公司)、TDL-5臺(tái)式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、SpectraMax-190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Moleculear Devices公司)、R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、pH酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 櫻桃核主要成分的測(cè)定

1.2.1.1 灰分的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取櫻桃核粉末1 g，按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)和方法(GB/T 5009.4-2016)進(jìn)行測(cè)定[9]。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取櫻桃核粉末20 g，采用雙縮脲試劑法測(cè)定[10]。以標(biāo)準(zhǔn)品牛血清清蛋白含量X為橫坐標(biāo)，A540為Y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程Y=0.048 4X+0.003 9，R2=0.998 5，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品在1～8 mg時(shí)與A540呈良好的線性關(guān)系。將待測(cè)樣品溶液測(cè)得的吸光值代入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品溶液的蛋白質(zhì)量并換算為100 g櫻桃核樣品中的蛋白質(zhì)含量g表示(g/100 g)。

1.2.1.3 可溶性總糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取櫻桃核粉末5 g，采用蒽酮比色法測(cè)定[11]。以標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖含量X為橫坐標(biāo)，A620為Y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程Y=1.503X+0.005 8，R2=0.992 9，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在10～80 μg時(shí)與A620呈良好的線性關(guān)系。將待測(cè)樣品溶液測(cè)得的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品溶液含糖量并換算為100 g櫻桃核樣品中總糖含量g表示(g/100 g)。

1.2.1.4 Vc含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取櫻桃核粉末2 g，采用2，4-二硝基苯肼比色法測(cè)定[12]。以標(biāo)準(zhǔn)品Vc含量X為橫坐標(biāo)，A500為Y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程Y=0.011 3X﹣0.001 3，R2= 0.996 7，Vc標(biāo)準(zhǔn)品在2～12 μg/mL與A500呈良好的線性關(guān)系。將待測(cè)樣品溶液測(cè)得的A500代入Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品溶液Vc含量并換算為100 g櫻桃核樣品中Vc含量mg表示(mg/100 g)。

1.2.1.5 脂質(zhì)含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取櫻桃核粉末1、3和5 g，采用索氏提取法提取脂質(zhì)再采用烘干法測(cè)定脂質(zhì)含量[13]，并換算為100 g櫻桃核樣品中的脂質(zhì)含量g表示(g/100 g)。

1.2.2 櫻桃核水溶性多糖的提取

準(zhǔn)確稱取櫻桃核粉末5 g，采用水溶醇沉方法從櫻桃核中提取水溶性多糖，再加入Sevage試劑去除游離蛋白，得櫻桃核水溶性多糖的提取液，置冰箱4 ℃保存待用[14]。

采用蒽酮比色法測(cè)定水溶性多糖的含量并計(jì)算提取率[14]。以標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖含量X為橫坐標(biāo)，A620為Y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程Y=5.375X+0.020 4，R2= 0.991 2，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.02～0.14 mg時(shí)與A620呈良好的線性關(guān)系。將待測(cè)樣品溶液測(cè)得的吸光值(平行測(cè)定3次后取平均值)代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品溶液的水溶性多糖含量，并按照公式1計(jì)算提取率。

櫻桃核多糖的提取率=

[(X×n×10-3)/W]×100%

(1)

式中：X為提取水溶性多糖的含量；W為櫻桃核粉末的重量(g)；n為溶液的稀釋倍數(shù)；10-3為毫克與克的單位換算因子。

1.2.3 櫻桃核水溶性多糖的體外抗氧化活性功效評(píng)價(jià)

1.2.3.1 總還原力的測(cè)定

采用普魯士藍(lán)法[15]，用0.03～0.05 mg/mL的Vc溶液做對(duì)照。

1.2.3.2 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

采用DPPH法[16,17]，用0.1～0.4 mg/mL的Vc溶液做對(duì)照。

1.2.3.3 對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定

采用水楊酸比色法等[18,19]，用0.1～0.4 mg/mL的Vc溶液做對(duì)照。

1.2.3.4 對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

采用ABTS法等[20]，用0.05～0.3 mg/mL的Vc溶液做對(duì)照。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)平行3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan多重比較法分析樣本間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃核主要成分的檢測(cè)結(jié)果

美早櫻桃核主要成分(灰分、蛋白質(zhì)、可溶性多糖、Vc和脂類物質(zhì))的含量見表1。由表1可知，蛋白質(zhì)含量最高，為18.80±0.30 g/100 g，與大紫紅櫻桃核中蛋白質(zhì)含量17.62±0.30 g/100 g相當(dāng)，但略低于嶗山紅櫻桃核的蛋白質(zhì)含量24.86±0.31 g/100 g[21]。脂質(zhì)含量次之，為8.97±0.58 g/100 g，高于大紫紅櫻桃核中脂質(zhì)含量6.11±0.14 g/100 g和嶗山紅櫻桃核中脂質(zhì)含量3.18±0.35 g/100 g[21]；本實(shí)驗(yàn)測(cè)得美早櫻桃核中可溶性總糖含量為4.96±0.14 g/100 g，Zeng等[21]實(shí)驗(yàn)測(cè)得大紫紅櫻桃核中還原糖含量為3.43±0.18 g/100 g，嶗山紅櫻桃核中還原糖含量為2.42±0.078 g/100 g。美早櫻桃核中灰分含量為1.49±0.08 g/100 g，高于大紫紅櫻桃核中灰分含量0.69±0.01 g/100 g和嶗山紅櫻桃核中灰分含量0.94±0.028 g/100 g[21]。Vc在美早櫻桃核中的含量為27.55±0.99 mg/100 g。美早櫻桃、嶗山紅櫻桃和大紫紅櫻桃是3個(gè)不同品種，櫻桃核基本成分含量的差異可為櫻桃核“變廢為寶”不同的開發(fā)利用方向提供理論參考。

表1 櫻桃核的主要成分檢測(cè)結(jié)果

2.2 櫻桃核水溶性多糖的含量和提取率

在620 nm測(cè)定吸光度值，櫻桃核水溶性多糖溶液的吸光度A=0.582，代入“1.2.2”中的回歸方程，得到櫻桃核多糖的含量為0.104 5 mg。按照公式1計(jì)算得櫻桃核多糖的提取率為2.09%。

2.3 櫻桃核水溶性多糖的總還原力

還原能力強(qiáng)的物質(zhì)因其化學(xué)本質(zhì)為還原劑，將會(huì)是良好的電子供體，研究發(fā)現(xiàn)總還原力與物質(zhì)的抗氧化活性呈正相關(guān)[22]。一般情況下具有較強(qiáng)還原能力的物質(zhì)能夠把Fe3+還原成Fe2+，根據(jù)顯色反應(yīng)可以判斷其還原程度，反應(yīng)后吸光度越大的物質(zhì)其還原能力越強(qiáng)[23]。由表2可知，隨櫻桃核水溶性多糖濃度的增加，總還原力也增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。當(dāng)櫻桃核水溶性多糖溶液濃度為0.40 mg/mL時(shí)，其總還原力(吸光值為0.25±0.02)為37.62±3.67 mg Vc/g。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明櫻桃核水溶性多糖具有較好的體外抗氧化能力，接下來(lái)進(jìn)行了櫻桃核水溶性多糖對(duì)DPPH、ABTS和羥基自由基清除能力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

表2 櫻桃核水溶性多糖的總還原力

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)，下同。

Note:Different letters in the same column showed significant differences(P<0.05),the same below.

2.4 櫻桃核水溶性多糖溶液對(duì)DPPH·清除能力

由表3可知，櫻桃核水溶性多糖溶液對(duì)DPPH·的清除能力表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著水溶性多糖濃度的增加，對(duì)DPPH·的清除能力也呈線性增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。櫻桃核水溶性多糖溶液濃度為0.64 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·清除率達(dá)72.94%。櫻桃核水溶性多糖溶液和Vc對(duì)DPPH·清除作用的IC50數(shù)值分別為0.31和0.19 mg/mL，說(shuō)明櫻桃核水溶性多糖具有較好的DPPH·體外清除能力。

表3 櫻桃核多糖對(duì)DPPH自由基的清除率

2.5 櫻桃核水溶性多糖對(duì)ABTS自由基清除能力

由表4可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著水溶性多糖質(zhì)量濃度的增加，櫻桃核水溶性多糖溶液對(duì)ABTS·的清除能力也呈線性增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。當(dāng)櫻桃核水溶性多糖溶液濃度為0.40mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS·清除率達(dá)64.29%，櫻桃核水溶性多糖溶液和Vc對(duì)ABTS自由基清除作用的IC50分別為0.32 和0.13 mg/mL，說(shuō)明櫻桃核水溶性多糖具有一定的ABTS自由基體外清除能力。

表4 櫻桃核多糖對(duì)ABTS自由基的清除率

2.6 櫻桃核水溶性多糖溶液對(duì)羥基自由基的清除能力

由表5可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著水溶性多糖質(zhì)量濃度的增加，櫻桃核水溶性多糖溶液對(duì)羥基自由基的清除能力也呈線性增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。0.40 mg/mL櫻桃核水溶性多糖溶液對(duì)羥基自由基清除率達(dá)62.88%，櫻桃核水溶性多糖溶液和Vc對(duì)羥基自由基清除作用的IC50分別為0.34和0.28 mg/mL，IC50數(shù)值表明櫻桃核水溶性多糖對(duì)羥基自由基的清除能力與Vc非常接近。因此，櫻桃核水溶性多糖對(duì)羥基自由基具有較好的清除效果。

表5 櫻桃核多糖對(duì)羥基自由基的清除率

3 結(jié)論與討論

灰分包含著人體所需的無(wú)機(jī)鹽和礦質(zhì)元素；蛋白質(zhì)、可溶性總糖、脂質(zhì)是活性成分，促進(jìn)生物體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定；Vc不僅是人體必須的水溶性維生素，而且是重要的抗氧化劑，可以預(yù)防牙齦萎縮出血，治療口腔潰瘍，還具排毒美白、增強(qiáng)人體免疫力的作用[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明美早櫻桃核含多種功能成分，其中蛋白質(zhì)含量最高，脂質(zhì)和多糖次之，再其次是灰分和Vc，美早櫻桃核具一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

植物多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、抑菌性、降血糖等多種生物活性，且對(duì)人體副作用小[25,26]。本實(shí)驗(yàn)采用水溶醇沉方法從櫻桃核中提取水溶性多糖，研究了櫻桃核水溶性多糖的總還原力及對(duì)DPPH、ABTS、羥基自由基的清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，櫻桃核水溶性多糖具有較強(qiáng)的還原能力和對(duì)DPPH、ABTS、羥基自由基的清除能力，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抗氧化能力與水溶性多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異。櫻桃核水溶性多糖對(duì)DPPH、ABTS、羥基自由基清除作用的IC50值分別為0.31、0.32和0.34 mg/mL，表明櫻桃核水溶性多糖的體外清除自由基功效非常穩(wěn)定。

目前，櫻桃產(chǎn)業(yè)利潤(rùn)大部分來(lái)源于櫻桃果實(shí)的當(dāng)季銷售，但櫻桃耐貯性不強(qiáng)，因此有了櫻桃酒、果汁、果脯、果醋等延續(xù)加工的產(chǎn)品，在這些產(chǎn)品加工過(guò)程中，大量櫻桃核由于外殼堅(jiān)韌而成為被丟棄的加工副產(chǎn)物，因此，“變廢為寶”開發(fā)加工丟棄的副產(chǎn)物櫻桃核，成為延伸櫻桃產(chǎn)業(yè)鏈提高櫻桃產(chǎn)業(yè)利潤(rùn)的發(fā)展方向。Zhang等[27]通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助酶解櫻桃核，得到了對(duì)·OH具有清除能力的抗氧化多肽。Sun[28]通過(guò)優(yōu)化快速溶劑萃取工藝制備了類黃酮，具有優(yōu)于Vc的抗氧化能力。Ren[29]研究顯示甜櫻桃核及其粗提物中含有總多酚、總多糖、總黃酮、總單寧和脂肪酸等活性成分，具有較好的抑菌和抗氧化生物活性。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)櫻桃核的脂溶性成分具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的抗氧化功能；Gong等[30]研究發(fā)現(xiàn)櫻桃核乙醇提取物具有體外抗氧化和降糖降脂的作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，美早櫻桃核的水溶性多糖具有較好且穩(wěn)定的體外抗氧化功效。由此可見，櫻桃核具有多種生物活性成分，且具有較好的抗氧化、抑菌、抗疲勞等生理功能。櫻桃核活性成分提取物具有天然、安全、有機(jī)、綠色等特點(diǎn)，作為抗氧化或抑菌的天然添加劑，符合“純天然、無(wú)刺激”的消費(fèi)需求，可加強(qiáng)在食品、飲品、化妝品等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的開發(fā)利用，從而延伸櫻桃產(chǎn)業(yè)鏈和提升櫻桃的利潤(rùn)空間。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，加工副產(chǎn)物櫻桃核的水溶性多糖具有較好且穩(wěn)定的體外抗氧化活性，下一步將對(duì)水溶性多糖進(jìn)行分離純化和成分鑒定，以期為櫻桃核的藥用保健功能及其多糖的抗氧化活性闡明機(jī)制。