花生芽中酚類物質(zhì)的大孔樹脂純化工藝研究

任汐月，陳可妍，戴京，鄭義，黃鐳，付曉燕

（武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北武漢430205）

花生種子發(fā)芽后可以作為芽菜食用，稱為花生芽，其口感清脆、風味獨特，頗受消費者歡迎[1]?；ㄉl(fā)芽后，其蛋白質(zhì)已分解為氨基酸，脂肪含量低，維生素含量全面提高，各種營養(yǎng)成分更易被人體吸收[2]。近年來國內(nèi)外研究者們在花生中發(fā)現(xiàn)了一種生物活性很強的天然多酚類物質(zhì)——白藜蘆醇，它是一種具有廣泛保健功能的成分，具有抗菌、抗癌、抗過敏、抗氧化等方面的藥理活性[3]，花生發(fā)芽后其含量大幅上升[2]。

隨著對天然產(chǎn)物開發(fā)利用越來越多關注，多酚已成為當今科學研究熱點[4]。然而其研究與應用需要以多酚的提取分離技術為基礎[5]，特別是多酚的純化是研究中不可缺少的環(huán)節(jié)。天然活性多酚的純化方法主要有：溶劑萃取法、樹脂吸附法、柱層析法、膜技術、高速逆流色譜法等[6]。大孔吸附樹脂具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用壽命長等優(yōu)點[7]，目前廣泛應用于酚類物質(zhì)的分離和富集，但對花生芽中酚類物質(zhì)的分離純化效果尚未見報道。

本研究從7種大孔樹脂中篩選出適用于花生芽中酚類物質(zhì)吸附分離的樹脂型號，對其靜態(tài)吸附-解吸條件和動態(tài)吸附-解吸條件進行優(yōu)化，旨在為花生芽中天然活性物質(zhì)的深入研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花生芽：網(wǎng)購；無水乙醇：北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；沒食子酸、無水碳酸鈉：天津市凱通化學試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸：國藥集團化學試劑有限公司；福林酚試劑：上海金穗生物科技有限公司；AB-8大孔樹脂：鄭州勤實科技有限公司；NKA-9、ADS-7大孔樹脂：天津市光復精細化工研究所；DM301、X-5、HP-20、S-8大孔樹脂：東鴻化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平（YP-5002）：上海佑科儀器有限公司；恒溫水浴鍋（B220）、旋轉蒸發(fā)器（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計（UV-2000）：尤尼柯（上海）儀器有限公司；pH計（FE20）：Metteler toledo公司；循環(huán)水式真空泵（SHZ-D）：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 花生芽中酚類物質(zhì)的提取

稱取一定質(zhì)量的花生芽樣品，采用70%乙醇溶液按1∶20（g/mL）料液比于60℃水浴鍋中浸提2 h，提取結束后抽濾，濾渣在相同條件下提取2次，合并濾液，使用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮除去乙醇，得花生芽酚類物質(zhì)粗提液，按需配制成不同質(zhì)量濃度的水溶液。

1.3.2 總酚濃度的測定

采用福林酚法。準確吸取0.5 mL樣液于25 mL比色管中，加入5 mL蒸餾水，0.5 mL福林酚試劑，混勻后加入20%的Na2CO3溶液1.5 mL，定容至10 mL，在25℃下靜置1 h后于765 nm下測定其吸光度，通過標曲計算提取液中總酚濃度（mg/mL）。沒食子酸標準曲線方程為 y=0.010 8x+0.003 4，R2=0.999 3。

1.3.3 大孔樹脂的預處理

將不同型號大孔樹脂分別置于無水乙醇中活化，不斷攪拌除去氣泡，靜置24 h，充分溶脹后，用蒸餾水洗至無醇味。先后使用2%NaOH溶液及5%HCl溶液洗滌，再用蒸餾水洗至中性，備用[8]。

1.3.4 大孔樹脂的篩選

準確稱取預處理好的 AB-8、NKA-9、DM301、HP-20、S-8、X-5、ADS-7 等 7 種大孔樹脂 1.0 g置于三角瓶中，分別加入已知質(zhì)量濃度的花生芽多酚粗提液30 mL，在25℃水浴搖床中以100 r/min的頻率振蕩吸附24 h，取上清液測定剩余的總酚濃度，計算各樹脂的吸附量（mg/g）。

將上述吸附飽和的樹脂取出，過濾后用蒸餾水沖洗至解吸液無色，去除樹脂表面殘留溶液，向已達吸附平衡的樹脂中加入70%乙醇溶液30 mL，在25℃水浴搖床中以100 r/min的頻率振蕩解吸24 h，取上清液測定總酚濃度，計算各樹脂的解吸率（%）。

式中：Q 為吸附量，mg/g；C0為起始質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為平衡質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附溶液體積，mL；W為樹脂質(zhì)量，g；D為解吸率，%；C為解吸后溶液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為解吸液體積，mL。

1.3.5 AB-8大孔樹脂的靜態(tài)吸附-解吸動力學曲線

分別取1.0 g已活化的AB-8大孔樹脂置于三角瓶中，加入已知質(zhì)量shi濃度的花生芽多酚粗提液30 mL，在25℃水浴搖床中以100 r/min的頻率振蕩吸附24 h，期間每隔一定時間取上清液0.1 mL，測定總酚濃度，繪制吸附動力曲線。取出吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗至無提取液殘留，加入70%乙醇溶液30 mL，在25℃水浴搖床中以100 r/min的頻率振蕩解吸24 h，期間每隔一定時間取上清液0.1 mL，測定總酚濃度，繪制解吸動力曲線。

1.3.6 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸條件的優(yōu)化

靜態(tài)吸附試驗分別取已活化的AB-8大孔樹脂1.0 g置于三角瓶中，加入多酚提取液30 mL，于水浴搖床中靜態(tài)吸附，吸附完全后取上清液測定總酚濃度，并計算吸附量（mg/g）。分別考察不同上樣液質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0、2.4 mg/mL） 和不同上樣液 pH 值（3、4、5、6、7、8）對 AB-8 大孔樹脂靜態(tài)吸附效果的影響。

靜態(tài)解吸試驗使用蒸餾水將充分吸附飽和的AB-8大孔樹脂清洗至表面無殘留，加入乙醇溶液30 mL，在水浴搖床中靜態(tài)解吸完全后，取上清液測定總酚濃度，并計算解吸率（%）。分別考察不同濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）乙醇溶液和不同乙醇溶液pH值（3、4、5、6、7、8）對 AB-8 大孔樹脂靜態(tài)解吸效果的影響。

1.3.7 大孔樹脂動態(tài)吸附-解吸條件的優(yōu)化

動態(tài)吸附試驗于Φ10 mm×200 mm的層析柱中濕法裝入5 g AB-8大孔樹脂，平衡后，將多酚提取液進行上樣吸附，收集流出液并測定不同體積流出液的總酚濃度，繪制多酚泄露曲線（當流出液中多酚質(zhì)量濃度達到原液中多酚質(zhì)量濃度的10%時，即為泄漏點[9]）。分別考察不同樣液濃度（0.8、1.0、1.2 mg/mL）和不同上樣流速（1.0、1.5、2.0 mL/min）對動態(tài)吸附效果的影響。

動態(tài)解吸試驗于Φ10 mm×200 mm的層析柱中濕法裝入5 g AB-8大孔樹脂，平衡后，將1.0 mg/mL的多酚提取液以1.5 mL/min的流速進行上樣吸附，吸附飽和后，用蒸餾水洗至流出液無明顯顏色，然后用乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液并測定不同體積洗脫液的總酚濃度，繪制多酚洗脫曲線。分別考察不同乙醇濃度（50%、60%、70%）和不同洗脫流速（1.0、1.5、2.0 mL/min）對動態(tài)解吸效果的影響。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

不同型號大孔樹脂的吸附量見圖1。不同型號大孔樹脂的解吸率見圖2。

圖1 不同型號大孔樹脂的吸附量Fig.1 Adsorption capacity of different types of macroporous resins

圖2 不同型號大孔樹脂的解吸率Fig.2 Desorption rate of different types of macroporous resins

由圖1可知，弱極性和極性樹脂對花生芽中酚類物質(zhì)的吸附能力較強，如AB-8、DM301和NKA-9，而非極性樹脂HP-20和X-5對酚類物質(zhì)的吸附能力較差，這與酚類物質(zhì)的結構有關，具有一定的極性和親水性，生成氫鍵的能力較強，有利于弱極性和極性樹脂對其吸附[10]。由圖2可知，DM301和NKA-9雖然對花生芽中酚類物質(zhì)的吸附量較高但解吸率較低，表明樹脂與多酚的結合能力較強，不利于其解吸，而HP-20雖然解吸率最強但對多酚的吸附量太低，綜合比較AB-8大孔樹脂的吸附量和解吸率均較為理想，是適用于花生芽中酚類物質(zhì)吸附分離的大孔樹脂類型。

2.2 AB-8大孔樹脂的靜態(tài)吸附-解吸動力學曲線

AB-8大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線見圖3，靜態(tài)解吸動力學曲線見圖4。

圖3 AB-8大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.3 Static adsorption kinetics curve of AB-8 macroporous resin

圖4 AB-8大孔樹脂的靜態(tài)解吸動力學曲線Fig.4 Static desorption kinetics curve of AB-8 macroporous resin

由圖3可知，在吸附前6 h內(nèi)，樹脂對酚類物質(zhì)的吸附量隨吸附時間的延長呈線性增加趨勢，到達6 h后，吸附速率逐漸變緩，表明此時樹脂已接近吸附平衡，繼續(xù)延長吸附時間，吸附量增加有限。由圖4可知，在解吸前4 h內(nèi)，隨著解吸時間的延長解吸率呈線性增加趨勢，超過4 h后解吸率上升趨勢變緩，到達6 h后解吸率趨于平衡。由此確定AB-8大孔樹脂對花生芽中酚類物質(zhì)的吸附-解吸平衡時間均為6 h。

2.3 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化

2.3.1 上樣pH值對靜態(tài)吸附效果的影響

上樣pH值對靜態(tài)吸附效果的影響見圖5。

不同pH值可以改變目標成分在溶液中的存在形式，影響其溶解度，并改變?nèi)芤簶O性，影響目標成分與大孔樹脂的分子間的作用力[11]。由圖5可以看出，當花生芽提取液pH值為3時吸附量最高，主要是由于提取液中含有大量酚羥基，在酸性條件下酚類物質(zhì)以分子狀態(tài)存在，更有利于被大孔樹脂吸附，而隨著pH值的增加，酚類物質(zhì)溶解性增大，不易與樹脂發(fā)生物理吸附作用。

圖5 上樣pH值對靜態(tài)吸附效果的影響Fig.5 Effect of pH value on static adsorption

2.3.2 樣液質(zhì)量濃度對靜態(tài)吸附效果的影響

樣液質(zhì)量濃度對靜態(tài)吸附效果的影響見圖6。

圖6 樣液質(zhì)量濃度對靜態(tài)吸附效果的影響Fig.6 Effect of sample concentration on static adsorption

由圖6可知，隨著樣液中總酚質(zhì)量濃度的提高，樹脂的吸附量呈上升趨勢，當樣液中總酚濃度為2.0 mg/mL時吸附量達到最大值，繼續(xù)增大樣液濃度，吸附量呈下降趨勢。造成這種現(xiàn)象的原因可能是當樣液濃度較低時由于酚類物質(zhì)被稀釋造成吸附動力較小，從而降低吸附量，而樣液濃度過高時其中雜質(zhì)含量隨之增高，會與多酚爭奪大孔樹脂的活性位點，造成多酚吸附量的下降[12]，且樣液濃度過高可能造成樹脂使用周期縮短，再生次數(shù)增多[13]。因此確定靜態(tài)吸附最佳樣液濃度為2.0 mg/mL。

2.3.3 乙醇濃度對靜態(tài)解吸效果的影響

乙醇濃度對靜態(tài)解吸效果的影響見圖7。

圖7 乙醇濃度對靜態(tài)解吸效果的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on static desorption

由圖7可知，隨著乙醇濃度的增加，多酚解吸率呈先上升后下降的趨勢，當濃度為60%時，解吸率最高，約為73.4%。在吸附階段，酚類物質(zhì)溶于水中，大孔樹脂對其吸附作用大于多酚與水之間的作用，多酚被吸附在樹脂上；當用乙醇溶液洗脫時，多酚與乙醇溶液間作用大于其與大孔樹脂的吸附作用，多酚被洗脫下來[14]。60%乙醇溶液對花生芽中酚類物質(zhì)有較好的洗脫效果，可能是由于60%乙醇與花生芽中多酚的極性最為接近，因而其相互作用最強。故選擇60%乙醇溶液作為洗脫溶劑較為適宜。

2.3.4 乙醇pH值對靜態(tài)解吸效果的影響

乙醇pH值對靜態(tài)解吸效果的影響見圖8。

圖8 乙醇pH值對靜態(tài)解吸效果的影響Fig.8 Effect of pH value of ethanol on static desorption

由圖8可知，隨著解吸液pH值的增加，多酚解吸率呈先下降后上升的趨勢，弱酸性環(huán)境下解吸率較低，酸性和弱堿性環(huán)境下有利于花生芽中酚類物質(zhì)的解吸，但長時間的堿性環(huán)境會使酚類物質(zhì)解離，引起分子結構和性質(zhì)的不可逆變化[13]，因此選擇解吸液pH值為3。

2.4 AB-8大孔樹脂動態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化

大孔樹脂對多酚的純化實際是一個動態(tài)的吸附-解吸過程，因此不能單純地通過靜態(tài)試驗來確定其對花生芽中酚類物質(zhì)的吸附、解吸能力[12]，有必要在此基礎上進一步開展動態(tài)試驗，并對影響動態(tài)吸附-解吸效果的因素進行優(yōu)化。

2.4.1 上樣濃度對動態(tài)吸附效果的影響

上樣濃度對動態(tài)吸附效果的影響見圖9。

圖9 上樣濃度對動態(tài)吸附效果的影響Fig.9 Effect of sample concentration on dynamic adsorption

由于動態(tài)試驗上樣體積較大，樣液濃度過高時容易對樹脂造成污染和阻塞，降低樹脂的吸附能力，故參考靜態(tài)試驗并適當降低上樣濃度。由圖9可知，隨著上樣量的增大，流出液中總酚濃度呈上升趨勢，當上樣濃度分別為0.8、1.0、1.2 mg/mL時，泄漏點分別出現(xiàn)在80、70、60 mL附近，主要是由于隨著樣液濃度提高傳質(zhì)速度變慢，且樹脂周圍的多酚分子過多，使得部分多酚沒來得及被吸附就流出來[10]，因而泄漏點提前。綜合考慮確定最佳動態(tài)吸附上樣濃度為1.0 mg/mL。

2.4.2 上樣流速對動態(tài)吸附效果的影響

上樣流速對動態(tài)吸附效果的影響見圖10。

圖10 上樣流速對動態(tài)吸附效果的影響Fig.10 Effect of sample flow rate on dynamic adsorption

由圖10可知，當上樣流速分別為1.0、1.5、2.0mL/min時，泄漏點分別出現(xiàn)在90、75、65 mL附近，隨著上樣流速的增加，泄漏點到達越提前，主要是由于樣液中的多酚分子沒有足夠的時間被大孔樹脂內(nèi)表面吸附就隨滲透液流出。上樣流速慢雖然有利于發(fā)揮樹脂的最大吸附效果，但會導致生產(chǎn)周期長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[15]。綜合考慮確定最佳上樣流速為1.5 mL/min。

2.4.3 乙醇濃度對動態(tài)解吸效果的影響

乙醇濃度對動態(tài)解吸效果的影響見圖11。

圖11 乙醇濃度對動態(tài)解吸效果的影響Fig.11 Effect of ethanol concentration on dynamic desorption

由圖11可知，隨著洗脫液流出體積的增大，不同濃度乙醇洗脫液中總酚濃度均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。30 mL～70 mL作為收集純化多酚濃度較高的區(qū)間，55mL左右達到峰值。當洗脫液體積超過80 mL時，花生芽多酚基本被洗脫完全。對比不同濃度乙醇的動態(tài)洗脫曲線可以看出，洗脫液中總酚濃度的大小順序為60%乙醇＞70%乙醇＞50%乙醇，200 mL洗脫液中其多酚總解吸率分別為82.1%、67.4%和58.1%，故最佳洗脫溶劑為60%乙醇溶液，與靜態(tài)解吸試驗結果一致。

2.4.4 洗脫流速對動態(tài)解吸效果的影響

洗脫流速對動態(tài)解吸效果的影響見圖12。

圖12 洗脫液流速對動態(tài)解吸效果的影響Fig.12 Effect of elution flow rate on dynamic desorption

由圖12可知，洗脫流速越快，動態(tài)洗脫曲線出峰時間越提前，且拖尾現(xiàn)象越明顯。對比不同流速下高濃度收集區(qū)間內(nèi)多酚洗脫總質(zhì)量可以看出，1.0、1.5、2.0 mL/min 多酚洗脫量分別為 39.8、35.5、19.4 mg，洗脫速率過大會導致洗脫溶劑未充分溶解樹脂中的多酚而過柱[16]，造成洗脫量降低。綜合考慮洗脫流速1.5 mL/min較為適宜，在此條件下多酚洗脫量較1.0 mL/min下降不大，但可縮短洗脫時間，減少洗脫劑用量，且洗脫曲線峰形相對集中、對稱，拖尾現(xiàn)象不明顯。

3 結論

通過對比7種型號大孔樹脂對花生芽多酚的吸附和解吸效果，從中篩選出AB-8為最佳樹脂類型。其最佳靜態(tài)吸附條件為：吸附平衡時間6 h、樣液pH3、樣液質(zhì)量濃度2.0 mg/mL，最佳靜態(tài)解吸條件為：解吸時間6 h、解吸液乙醇濃度60%、解吸液pH3。在此基礎上開展AB-8大孔樹脂對花生芽中酚類物質(zhì)的動態(tài)吸附-解吸試驗，其最佳動態(tài)吸附條件為上樣濃度1.0 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min，最佳動態(tài)解吸條件為洗脫液乙醇濃度60%、洗脫流速1.5 mL/min。在此條件下對花生芽中酚類物質(zhì)進行純化，有助于進一步開展花生芽中酚類物質(zhì)的組成分析、生物活性等深入研究。