戊乙奎醚對肺缺血再灌注損傷SP-A的影響及其與HMGB1-RAGE信號通路的關系

張志洋 高滿海 趙志英 姜寒薇 李慧君 武建斌

(包頭醫(yī)學院 1第一附屬醫(yī)院，內蒙古 包頭 014000；2麻醉學院；3 2015 級麻醉專業(yè)本科生)

缺血再灌注導致的肺損傷是休克、肺移植、單側肺通氣及體外循環(huán)術后肺功能障礙的重要因素，及時合理防治對減少肺缺血再灌注損傷(LIRI)具有重要臨床意義。戊乙奎醚作為一種高選擇抗膽堿能藥物，已廣泛用于麻醉前用藥、有機磷農藥中毒搶救及改善微循環(huán)等方面。近來研究發(fā)現(xiàn)，戊乙奎醚在預防和治療急性肺損傷中有良好的保護作用〔1〕，其通過抑制血清中高遷移率族蛋白(HMG)B1、肺表面活性蛋白(SP)-A的表達，增加支氣管腫泡灌洗液(BALF)中SP-A的表達，對大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷具有顯著療效〔2〕。但關于戊乙奎醚預處理對LIRI的作用鮮見報道。本研究擬用Wistar大鼠建立LIRI模型，探究戊乙奎醚對LIRI的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1動物及試劑 健康Wistar雄性大鼠120只，體重250～300 g，購于內蒙古大學實驗動物中心。鹽酸戊乙奎醚注射液批號：20090511-1，購自成都力思特制藥股份有限公司。

1.2動物分組和模型制備 將120只Wistar雄性大鼠隨機分為假手術組(S組)、LIRI模型組(LIRI組)、戊乙奎醚低劑量組及高劑量組(P1組及P2組)每組30只。4組均采用1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，參照廖秀清等〔3〕建立的LIRI模型，左側第5肋間開胸，于呼氣末以無損傷血管鉗夾閉左肺門，缺血45 min后開放灌注2 h；S組僅游離肺門，但不夾閉；P1、P2組分別于術前1 h靜脈注射戊乙奎醚0.3 mg/kg和1.0 mg/kg，S組與LIRI組分別給予等容量的生理鹽水。

1.3肺組織濕干質量比 (W/D) 取左肺組織，濾紙吸凈表面液體，天平稱其濕重后，置于70℃電熱恒溫干燥箱內，48 h后稱其干重，計算W/D。

1.4肺組織病理學觀察 取左肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.5Western印跡法檢測各組肺組織中HMGB1、SP-A蛋白表達 將各組肺組織加入RIPA裂解液裂解細胞，提取上清液。用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品(20 μg/孔)。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG為第二抗體，室溫孵育1 h，電化學發(fā)光法(ECL)顯色，以β-肌動蛋白(Actin)為內參，通過凝膠成像系統(tǒng)進行蛋白表達量的半定量分析。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、LSD法。

2 結 果

2.1各組肺組織病理學觀察 顯微鏡下可見S組肺組織結構清晰；LIRI組肺組織結構破壞嚴重，肺泡間隔增寬，肺間質充血水腫，有明顯的炎癥細胞浸潤和紅細胞滲出，肺部損傷最嚴重；P1、P2組肺組織結構、肺泡間隔及肺間質充血水腫情況較LIRI組減輕，同時P1組較P2組肺組織損傷輕，見圖1。

圖1 各組肺組織病理學比較(HE，×100)

2.2各組W/D比較 與S組比較，LIRI組、P1組、P2組W/D顯著升高(P<0.05)；與LIRI組比較，P1組、P2組W/D顯著降低，且P2組顯著低于P1組(P<0.05)，見表1。

2.3各組肺組織中HMGB1、SP-A蛋白表達比較 與S組比較，LIRI組、P1組、P2組肺組織中HMGB1表達顯著升高，SP-A表達顯著降低(P<0.05)；與LIRI組比較，P1組、P2組HMGB1表達顯著降低，SP-A表達顯著升高(P<0.05)，且P2組HMGB1表達降低和SP-A表達升高較P1組更明顯(P<0.05)，見表1，圖2。

表1 各組肺組織W/D值、HMGB1、SP-A 表達比較

與S組比較：1)P<0.05；與LIRI組比較：2)P<0.05；與P1組比較：3)P<0.05

圖2 各組肺組織中HMGB1、SP-A蛋白表達

3 討 論

LIRI是影響術后早期肺功能恢復的關鍵性因素，其主要特征是發(fā)生局部和全身的炎癥反應，此類反應可引起多種細胞因子介導的肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞的損傷及凋亡〔4〕。

SP-A在促使肺泡炎癥消退、抑制AT-Ⅱ的凋亡及降低肺泡表面張力等方面具有重要作用，可預防肺泡萎陷和肺不張〔5，6〕，當肺發(fā)生缺血再灌注損傷時會使得該蛋白含量減少。本實驗結果與吳畏等〔7〕的研究結果吻合，即當肺發(fā)生急性損傷時，可出現(xiàn)SP-A蛋白表達下調，加劇肺部炎癥反應，使肺損傷進一步惡化。HMGB1作為重要的晚期炎癥因子與晚期糖基化終末產物受體(RAGE)結合，可誘導炎癥細胞因子的轉錄和表達進而引起炎癥反應的瀑布效應〔8〕，加重肺泡-毛細血管屏障的損傷，細胞膜通透性增加，SP-A進入血液循環(huán)，肺組織中SP-A含量進一步下降。本研究結果提示LIRI可能激活了HMGB1-RAGE信號通路，引起HMGB1的過表達，加劇了肺部炎癥反應。Kao等〔9〕、陸建峰等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，對急性肺損傷大鼠應用HMGB1抑制劑治療，可抑制HMGB1蛋白表達上調，從而減輕炎癥細胞的聚集和肺水腫，對肺損傷產生保護作用。戊乙奎醚作為新型抗膽堿藥，廣泛用于器官缺血再灌注損傷的保護，選擇作用于M1、M3受體，對肺的保護機制除解除支氣管平滑肌痙攣外，還可提高肺組織對缺血缺氧的耐受性，降低肺毛細血管通透性，改善微循環(huán)；抑制肺部炎癥反應，從而減輕肺水腫并改善通氣〔11，12〕。本實驗研究結果表明戊乙奎醚對LIRI大鼠肺組織起到保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺發(fā)生缺血再灌注損傷時可能伴隨HMGB1-RAGE信號通路的激活及HMGB1蛋白的過表達。其中，HMGB1-RAGE信號通路與炎癥反應密切相關，HMGB1與RAGE結合后使得下游P38MAPK磷酸化和核因子(NF)-κB活化，誘導炎癥因子轉錄表達，產生炎癥效應和免疫應答，導致缺血再灌注損傷的發(fā)生〔13〕。本研究證明戊乙奎醚有助于減輕LIRI。同時，戊乙奎醚可能阻斷了HMGB1-RAGE信號通路，抑制HMGB1的過表達，阻止因炎癥因子HMGB1的大量產生和聚集引起的炎癥瀑布效應，有利于減輕肺部炎癥反應，且戊乙奎醚高劑量組對肺損傷的改善效果優(yōu)于低劑量組。

綜上，戊乙奎醚能夠抑制LIRI時HMGB1-RAGE信號通路的激活，增加肺組織中SP-A的表達，對缺血再灌注損傷的肺組織起保護作用。