針刺尿三針對良性前列腺增生大鼠的療效

黃林 方浩泰 王梓楠 林亨 袁青

(廣州中醫(yī)藥大學 1針灸康復臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；2附屬湛江第二中醫(yī)院)

良性前列腺增生癥(BPH)是一種非惡性、無調(diào)控生長的疾病，由過渡區(qū)和尿道周圍的上皮細胞和纖維肌組織的結(jié)節(jié)性過度生長所導致〔1〕。BPH臨床癥狀主要有前列腺體積(PV)增大、下尿路癥狀(LUTS)、反復泌尿道感染、急性尿潴留等，嚴重影響患者生活質(zhì)量。BPH發(fā)病率與年齡相關，大約從40歲開始，隨著年齡的增長,其發(fā)病率呈上升趨勢〔2〕。隨著全世界人口老齡化，BPH發(fā)病率不斷增高，BPH不論儲尿期癥狀，還是排尿期癥狀，均會對患者造成很大痛苦，嚴重者會引起腎后性腎功能衰竭，危及生命。BPH是一種多因素疾病，雄激素、雌激素、基質(zhì)上皮相互作用、生長因子和神經(jīng)遞質(zhì)可能單獨或聯(lián)合在病因?qū)W中發(fā)揮作用〔3〕。因BPH組織中雄激素和雌激素的作用都有所增強〔4〕，激素水平的改變被多數(shù)人認為是其主要原因，又有研究表明，它們對前列腺細胞的作用都是間接的，生長因子才是直接作用的介質(zhì)，BPH中堿性成纖維生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β2這兩種生長因子均表達增高〔5〕。本研究對BPH大鼠模型進行針刺尿三針治療，觀察雌激素及相應生長因子表達水平，探討針刺尿三針對BPH病理過程的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 18只體重250～300 g的成年雄性健康SD大鼠購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心〔質(zhì)量合格證號:SCXK(粵)2016-0041,等級SPF〕。所有大鼠在廣州中醫(yī)藥大學青蒿研究所采用分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為20～26℃，濕度為40%～70%，14 h晝夜間斷照明，保持籠內(nèi)整潔干燥、注意通風換氣。喂養(yǎng)選用全價顆粒飼料，自由進食飲水，及時更換墊料。

1.2實驗藥物 食用橄欖油；丙酸睪酮注射液(規(guī)格：1 ml:25 mg)，產(chǎn)品批號：131208，購于上海通用藥業(yè)股份有限公司；大鼠雙氧睪酮(DHT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠雌二醇(E2) ELISA試劑盒、大鼠堿性成纖維生長因子(bFGF) ELISA試劑盒、大鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β2 ELISA試劑盒，均購于武漢華美生物有限公司；水合氯醛AR，購于東巨有限公司。

1.3主要儀器 臺式高速離心機，產(chǎn)品批號D3024R，購于賽洛捷克公司；多功能酶標儀，產(chǎn)品批號 DG5033A，購于南京東華電子有限公司；F1移液器，產(chǎn)品批號Finnpipette，購于中國Thermofisher公司。

1.4實驗流程

1.4.1運用隨機數(shù)字表法將18只健康成年雄性SD大鼠分為正常組、模型組、針刺組，每組各6只。

1.4.2造模方法 采取不去勢方法，模型組和針刺組以5 mg/(kg·d)丙酸睪酮皮下注射，連續(xù)28 d，每日稱重后調(diào)整丙酸睪酮的注射量；相同時間給予正常組等量的橄欖油皮下注射。造模完成采取單籠喂養(yǎng)，每天保證提供足量的鼠糧、干凈的飲用水，及時更換墊料。

1.4.3治療方法 針刺組于造模后次日起給予針刺干預，每日干預時間固定，將大鼠用固定器固定，選用華佗牌0.18 mm×10 mm的毫針，取“靳三針療法”中尿三針穴組(中極、關元、三陰交，定位參考文獻〔6〕)，中極向下斜刺3 mm，關元向下斜刺3 mm，三陰交直刺3 mm，進針后，模擬在人體操作捻轉(zhuǎn)手法，拇、食指捏握針柄勻速捻轉(zhuǎn)20次，幅度在180°～360°之間，完成后不留針，立刻出針，如針孔有出血則用脫脂棉球按壓。針刺干預頻率為每日1次，連續(xù)21 d。模型組和正常組每天同一時間行空抓,時間為1 min，空抓時模型組大鼠與正常組大鼠均用固定器固定，而不給予針刺干預。見圖1。

圖1 大鼠空抓與針刺干預

1.4.4取材方法 取材前1天禁食12 h，禁水6 h。針刺干預21 d結(jié)束后，大鼠稱重后，采取7%水含氯醛(1 ml/kg)注射于腹腔右下部(0.3 ml/100 g)，麻醉成功后，固定于手術臺，摘取完整的膀胱與前列腺組織，將周圍脂肪清除干凈，10%甲醛定大鼠前列腺，石蠟包埋、切片。腹主動脈插管采空腹血5 ml，4℃靜置3～4 h，3 000 r/min離心10 min，選取上層血清，于-70℃環(huán)境中保存。

1.4.5檢測指標及方法

1.4.5.1前列腺指數(shù)測定 電子天平測量前列腺組織濕重，公式：大鼠前列腺指數(shù)(PI)=前列腺濕重(mg)/大鼠體重(g)。

1.4.5.2ELISA測定大鼠血清DHT、E2、bFGF和TGFβ2水平 (1)依據(jù)待測樣品加上標準品的數(shù)量確定板條數(shù)，盡量使用復孔操作。(2)反應孔內(nèi)加入調(diào)配好的標準品、待測樣品各50 μl。隨即繼續(xù)加入50 μl經(jīng)生物素標記的抗體。將膜板蓋上，將反應孔內(nèi)液體振蕩至均勻，于37℃空間溫育45 min。去除反應孔里的液體，加入洗滌液，振蕩30 s，清洗反應孔，用吸水紙拍干。重復此操作4次。假設使用洗板機，則增加1次清洗的次數(shù)。(3)每個反應孔內(nèi)加入100 μl的親和鏈酶素，將孔內(nèi)液體振蕩至均勻，37℃空間溫育30 min。去除反應孔里的液體，洗滌液加滿每個反應孔，振蕩30 s，去除洗滌液后用吸水紙拍干。重復此操作4次。假設使用洗板機，則增加一次清洗的次數(shù)。每個反應孔分別加入50 μl底物A、B，將孔內(nèi)液體振蕩至均勻，37℃空間溫育5 min。避免光照。取出酶標板，立即加入50 μl終止液，測定結(jié)果。在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件結(jié)合STATA13.0軟件分析，多組計量數(shù)據(jù)的均數(shù)比較，經(jīng)檢測符合正態(tài)分布且方差齊，則采用單因素方差分析，組間比較用LSD-t法；方差不齊的數(shù)據(jù)秩轉(zhuǎn)換后進行方差齊性檢驗。

2 結(jié) 果

2.1實驗動物脫落情況 18只SD大鼠無脫落情況，均納入結(jié)果分析。

2.2各組前列腺濕重和前列腺指數(shù) 與正常組相比，模型組和針刺組前列腺濕重及前列腺指數(shù)均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，針刺針組前列腺濕重及前列腺指數(shù)均明顯降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組前列腺濕重及前列腺指數(shù)比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3各組激素DHT、E2、bFGF和TGF-β2的表達情況 與正常組相比較，模型組的DHT和bFGF、E2和TGF-β2表達水平明顯增加(P<0.05)；與模型組相比較，針刺組DHT和bFGF的表達水平有明顯降低(P<0.05)，E2和TGF-β2的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清中激素DHT、bFGF、E2 和TGF-β2表達水平的比較

與模型組比較：1)P<0.05

3 討 論

BPH是中老年男性的常見病，特征是前列腺上皮和基質(zhì)組織的異常增生，嚴重影響中老年人生活質(zhì)量。西方醫(yī)學在BPH 臨床治療手段方面最有效的方法是手術，但手術對于老年人來說存在較多風險。運用針刺方法治療本病具有起效時間快、經(jīng)濟安全、病人接受度高等優(yōu)點。

本實驗與常用BPH大鼠造模方法不同，采用的是不去勢的情況直接皮下注射丙酸睪酮來建立動物模型，考慮到去勢后再皮下注射丙酸睪酮造模方法因大鼠睪丸被去除，雄性激素分泌會大量減少，將打破雌/雄激素水平在大鼠體內(nèi)的生理性平衡，故不去勢的造模方法更有利于本研究結(jié)果的科學性，同時也證實本研究設想雄激素含量的升高是刺激前列腺增生的必要條件〔7〕。模型組的前列腺濕重與前列腺指數(shù)均顯著高于正常組，提示造模成功。

BPH的病因有多種說法，如激素失衡、代謝綜合征、年齡和慢性炎癥，然而，其病因尚不清楚。在這些因素中，雄激素水平的增加被認為與BPH發(fā)病機制關系最密切，雄激素在前列腺的發(fā)育和分化中起中心作用，去勢大鼠給予外源性雄激素后，萎縮的前列腺組織恢復生長，另外臨床治療BPH的用藥思路為阻斷雄激素信號通路，如非那雄胺為臨床治療BPH的常用藥，由此也可推斷雄激素與前列腺的生長發(fā)育關系密切〔8〕。前列腺組織內(nèi)的主要雄激素為DHT，DHT屬于睪酮(T)的代謝產(chǎn)物，DHT能刺激前列腺腺體的組織增生，進而引起一系列下尿路梗阻的癥狀〔9〕。5α還原酶于前列腺間質(zhì)中具有較高活性,它能將T轉(zhuǎn)化為DHT。DHT的效能是T的5倍,DHT作用于前列腺必須與雄激素受體(AR)結(jié)合,AR是胞核受體,起轉(zhuǎn)錄因子的作用，并控制各種靶基因的表達，AR與DHT的結(jié)合能夠調(diào)節(jié)bFGF而對前列腺間質(zhì)和上皮細胞的生長產(chǎn)生刺激作用，從而導致前列腺間質(zhì)異常生長〔10〕。

BPH的性激素失衡并不只是由雄激素的變化引起的，雌激素在前列腺增生過程中也發(fā)揮作用,其中最主要、活性最強的激素是E2。研究認為〔11〕，雄激素通過局部基質(zhì)芳構(gòu)化產(chǎn)生的雌激素參與了平滑肌細胞的生長和分化，才導致BPH的發(fā)生。引發(fā)的機制可能通過兩種途徑〔12〕：①雌激素產(chǎn)生作用是通過促進垂體催乳素分泌；②可提高前列腺內(nèi)AR表達水平,而這兩者的增加均能增強雄激素作用?；谶@些觀察，抗雌激素特別是芳香化酶抑制劑已被用于治療BPH引起的下尿路癥狀。然而，使用芳香化酶抑制劑的大規(guī)模、三期隨機臨床試驗一直令人失望，因此沒有采用這種方法。

在BPH組織中雌、雄激素表達水平均出現(xiàn)不同程度的增高，bFGF和TGF-β2相應增高。TGF-β2的表達水平隨著雌激素增強而出現(xiàn)顯著增高,bFGF表達無變化趨勢〔5〕。生長因子才是直接促進前列腺細胞的發(fā)育、分化的介質(zhì)，雌雄激素屬于間接起作用。生長因子是細胞增殖、分化的重要遞質(zhì)，前列腺細胞生長、死亡等也與其有密切的關系。

BPH在中醫(yī)屬于“精癃”、“癃閉”范疇，運用中醫(yī)藥方法在治療BPH中效果顯著。本研究選用“尿三針”為嶺南針灸名家靳瑞教授創(chuàng)立的靳三針療法中的穴組，以中醫(yī)基礎理論與黃帝內(nèi)經(jīng)，總結(jié)古今針灸臨床經(jīng)驗和研究成果，通過多年的臨床驗證和實驗研究的結(jié)果整理而來?！澳蛉槨敝委烞PH引發(fā)的癥狀，尤其是對尿頻、尿不盡、尿潴留等都有十分理想的療效。中醫(yī)理論認為，BPH是因年邁氣血虧虛，腎氣、腎陽日漸衰弱，腎臟溫煦、氣化功能減退，或脾氣虛弱，升清降濁調(diào)，導致水濕泛濫，或情志不舒，肝氣郁滯，影響三焦氣化及水液運行，病位主要在腎與膀胱，也跟脾、肝二臟有關。足太陽膀胱經(jīng)與足少陰腎經(jīng)互為表里屬絡關系，膀胱是貯存和排泄尿液的器官，尿液的生成排泄有賴于脾的升清降濁、肝氣舒暢及腎氣的蒸化作用。各臟腑功能紊亂則出現(xiàn)尿液失常癥狀，治療原則應為補益腎氣為主，兼以調(diào)補益脾胃、調(diào)暢氣機?！澳蛉槨毖ńM由中極、關元和三陰交組成。中極為任脈穴位，又是足太陽膀胱經(jīng)募穴，凡膀胱功能失職皆可選用，有舒暢膀胱氣機的作用，可推動膀胱收縮而排尿。關元穴是人體真氣、元氣發(fā)生之地，是人之根本，具有補益腎氣、溫陽補腎的作用，可促進腎氣的蒸騰氣化作用。三陰交為足三陰經(jīng)交匯之處，可同時調(diào)節(jié)肝、脾、腎三經(jīng)氣血，治療尿頻、癃閉等病癥效果佳。此穴組可起到調(diào)補腎氣，溫煦腎陽，疏導肝脾氣機，而有效治療BPH。

本研究前列腺濕重及前列腺指數(shù)方面結(jié)果提示一定劑量的外源性雄激素可促使大鼠的前列腺增生，針刺尿三針穴組可以有效地抑制由DHT所致大鼠前列腺增生癥所引起的泌尿器官重量的指數(shù)升高。

組織學方面，BPH的特征是尿道周圍的腺體和間質(zhì)組織存在進行性增生，并伴有過度的結(jié)節(jié)性生長，bFGF介導雄激素刺激前列腺組織增生，可以增強BPH中涉及的細胞生長和新生血管的形成〔13〕，組織增生程度與bFGF濃度的增加相關。本研究結(jié)果表明大鼠前列腺性增生可由雄激素引起，雄激素具有上調(diào)間質(zhì)細胞中 bFGF表達的作用，不斷增多的間質(zhì)細胞在DHT作用下又不斷產(chǎn)生bFGF，誘導前列腺上皮細胞的生長和分化〔14〕。本研究結(jié)果表明針刺尿三針穴組可以有效降低BPH 大鼠的DHT水平，進而減少bFGF的分泌，從而達到抑制前列腺增生的作用。在細胞異常增殖過程中所涉及的生長因子的鑒定對于理解BPH的發(fā)生機制具有重要意義。事實上，抑制與前列腺增生有關的生長因子或其受體的合成或活性，對前列腺病理的預防和治療具有重要意義。與正常組相比，BPH SD大鼠中雌激素水平有所升高，影響TGF-β2表達水平也相應升高。與模型組相比，針刺組E2和TGF-β2的表達水平從數(shù)值上看是有降低的，針刺“尿三針”穴組對降低BPH大鼠E2效果不明顯，考慮由于男性體內(nèi)雌激素有70%來自雄激素在外周的芳香化作用轉(zhuǎn)變而來〔15〕，模型組和針刺組每天都注射雄激素，部分外源性雄激素轉(zhuǎn)化成了雌激素，雌激素在BPH的維持中起到了一定作用，而不是誘發(fā)，同時雌激素受體在BPH組織中的含量極微，不發(fā)揮重要作用〔16〕，故針刺組對降低雌激素效果不明顯。針刺“尿三針”穴組后，雄激素水平明顯下降。因此，針刺“尿三針”穴組主要通過降低BPH 大鼠前列腺組織中DHT、bFGF的表達水平，從而抑制前列腺組織的增生，達到治療前列腺增生的療效。