姜黃素抑制白細(xì)胞介素8誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的分子機(jī)制

王曉寒 趙旭 廣東

(1河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南 安陽 455000；2大慶市大慶油田總醫(yī)院胸外科)

當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時(shí)，如轉(zhuǎn)移性腫瘤、原發(fā)性腫瘤、微動(dòng)脈瘤和海綿狀血管畸形，血管提供的營(yíng)養(yǎng)不能滿足腫瘤的迅速生長(zhǎng)時(shí)，血管生成相關(guān)因子大量產(chǎn)生并促進(jìn)形成新生血管〔1，2〕。而血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移在血管生成中起關(guān)鍵作用，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖可在原有血管的基礎(chǔ)上以芽生或非芽生方式形成新血管〔3〕。新生血管形成是腫瘤生長(zhǎng)的必要條件，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)新生血管形成〔4〕。姜黃素(CUR)是一種從姜黃中提取的天然疏水性多酚，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用〔5〕，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎〔6〕、胰腺炎〔7〕等疾病的治療具有良好的效果。研究表明〔8，9〕，CUR通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素(IL)等炎性細(xì)胞因子水平，減輕缺血/再灌注損傷，從而對(duì)心、腎、肝等器官損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本文擬探討CUR對(duì)IL-8誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 HUVECs人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(批號(hào)：PCS-100-010)購(gòu)自ATCC；CUR(批號(hào)：207-280-5)購(gòu)自湖州浦瑞生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；PD98059(簡(jiǎn)稱PB，批號(hào)：T2623)購(gòu)自美國(guó)TargetMol公司；胎牛血清(批號(hào)：10099-141)、胰蛋白酶(批號(hào)：25200056)、RPMI1640培養(yǎng)液(批號(hào)：61870044)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號(hào)：PC0020)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號(hào)：BSP0161)、電化學(xué)發(fā)光液(批號(hào)：PE0030)、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(批號(hào)：R0020)、結(jié)晶紫(批號(hào)：C8470)、4%多聚甲醛(批號(hào)：P1110)、二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：D8370)購(gòu)自Solarbio公司；Transwell小室(批號(hào)：BD-353502)購(gòu)自北京明陽科華生物技術(shù)有限公司；兔抗人β-actin多克隆抗體(批號(hào)：XFC1655)購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司；VEGF兔多克隆抗體(批號(hào)：ABP57460)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2多克隆抗體(批號(hào)：ABP51299)購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；磷酸化(p)-ERK兔多克隆抗體(批號(hào)：ab77654)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自Abcam公司；熒光顯微鏡購(gòu)自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司；MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2 d換液一次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，加入胰酶消化并吹散成單個(gè)細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于24孔板，隨機(jī)分為對(duì)照(Control)組、IL-8 50 ng/ml組、IL-8 100 ng/ml組、IL-8 200 ng/ml組、IL-8組、IL-8+CUR 15 ng/ml組、IL-8+CUR 30 ng/ml組、IL-8+CUR 45 ng/ml組、IL-8+DMSO組和IL-8+PD組。處理方法：IL-8 50 ng/ml組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為50 ng/ml的IL-8；IL-8 100 ng/ml組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為100 ng/ml的IL-8；IL-8 200 ng/ml組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為200 ng/ml的IL-8；IL-8組經(jīng)濃度篩選后，100 ng/ml IL-8效果最佳，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)并記為IL-8組；IL-8+CUR 15 ng/ml組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 ng/ml IL-8和15 ng/ml CUR共同孵育；IL-8+CUR 30 ng/ml組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 ng/ml IL-8和30 ng/ml CUR共同孵育；IL-8+CUR 45 ng/ml組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 ng/ml IL-8和45 ng/ml CUR共同孵育；IL-8+PD組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 ng/ml IL-8和50 μmol/L的PD；IL-8+DMSO組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 ng/ml IL-8和與PD等量的DMSO。

1.3Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移 使用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel并加入到Transwell小室上室膜上，37℃ 孵育30 min，制成與細(xì)胞基底膜類似的一層膜。將上述各組細(xì)胞饑餓培養(yǎng)12 h，加入胰酶消化細(xì)胞，離心收集并計(jì)數(shù)，制成濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液并接種于上室。下室中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，將上室放入下室中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。磷酸鹽緩沖液洗滌并用棉簽輕輕擦去上層未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)取平均值。

1.4Western印跡 取Control組、IL-8組、IL-8+CUR 15 ng/ml組、IL-8+CUR 30 ng/ml組、IL-8+CUR 45 ng/ml組、IL-8+DMSO組和IL-8+PD組細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，4℃，10 000 r/min離心15 min取上清。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后將蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入VEGF(1∶500)、ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體，4℃孵育過夜；洗膜后加入HRP酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，每次10 min，電化學(xué)曝光顯影。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1IL-8促進(jìn)HUVECs細(xì)胞遷移 IL-8 50 ng/ml組、IL-8 200 ng/ml組、IL-8 100 ng/ml組的HUVECs細(xì)胞遷移〔(239.21±19.56)個(gè)、(356.78±39.26)個(gè)、(460.87±41.26)個(gè)〕顯著高于Control組〔(129.46±13.86)個(gè)〕。且IL-8 100 ng/ml組通過Transwell小室膜上遷移孔的細(xì)胞數(shù)最多(P<0.05)；選取100 ng/ml IL-8用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2CUR抑制IL-8誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞遷移 對(duì)比Control組〔(133±14)個(gè)〕，IL-8+CUR 15 ng/ml組〔(332±35)個(gè)〕、IL-8+CUR 30 ng/ml組〔(276±26)個(gè)〕、IL-8+ CUR 45 ng/ml組〔(193±18)個(gè)〕能夠顯著促進(jìn)HUVECs細(xì)胞遷移(P<0.05)，IL-8+CUR 30 ng/ml、IL-8+CUR 45 ng/ml組顯著低于IL-8 CUR 15 ng/ml組(P<0.05)。

2.3CUR抑制IL-8誘導(dǎo)的VEGF表達(dá) 與Control組(0.51±0.06)相比，IL-8組可顯著上調(diào)HUVECs細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)(0.75±0.07,P<0.05)，而IL-8+CUR 15 ng/ml、IL-8+CUR 30 ng/ml和IL-8+CUR 45 ng/ml組能夠濃度依賴性抑制IL-8誘導(dǎo)的VEGF蛋白表達(dá)(0.65±0.07,0.31±0.04,0.33±0.05)，且IL-8+CUR 30 ng/ml、IL-8+CUR 45 ng/ml組顯著高于IL-8+CUR 15 ng/ml組(均P<0.05)，見圖1。

2.4CUR抑制IL-8誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號(hào)通路激活 各組ERK1/2蛋白表達(dá)水平無明顯變化，而IL-8組細(xì)胞中p-ERK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，而經(jīng)CUR處理后pERK蛋白表達(dá)水平較IL-8組顯著降低(P<0.05)。見表1，圖2。

1～5:Control組、IL-8組，IL-8+CUR 15 ng/ml組，IL-8+CUR 30 ng/ml組，IL-8+CUR 45 ng/ml組；圖2同圖1 HUVECs細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)

組別ERK1/2p-ERK1/2Control 組1.35±0.090.65±0.05IL-8組1.33±0.130.89±0.091)IL-8+CUR 15 ng/ml組1.28±0.140.84±0.052)IL-8+CUR 30 ng/ml組1.35±0.120.71±0.062)IL-8+CUR 45 ng/ml組1.32±0.140.73±0.072)F/P值0.158/0.9556.722/0.007

與Control組比較：1)P<0.05；與IL-8組比較：2)P<0.05

圖2 Western印跡檢測(cè)HUVECs細(xì)胞中ERK1/2和 p-ERK1/2的表達(dá)

2.5PD對(duì)IL-8誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞遷移和VEGF表達(dá)的影響 對(duì)比Control組，IL-8可顯著促進(jìn)HUVECs細(xì)胞遷移及細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)(P<0.05)，加入MAPK/ERK信號(hào)通路抑制劑處理后，細(xì)胞遷移率及細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表2，圖3。

表2 PD抑制IL-8誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和 VEGF蛋白表達(dá)

與Control組比較：1)P<0.05；與IL-8+DMSO組比較：2)P<0.05

3 討 論

IL-8主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔10，11〕。據(jù)報(bào)道〔12〕，IL-8能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)細(xì)胞耐藥性，并通過誘導(dǎo)腫瘤血管生成促進(jìn)肺癌發(fā)展。IL-8通過與細(xì)胞表面G蛋白耦聯(lián)受體CX趨化因子受體(CXCR)1和CXCR2結(jié)合發(fā)揮作用：IL-8與內(nèi)皮細(xì)胞表面CXCR1和CXCR2受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞收縮，增大血管通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移〔13〕。此外，IL-8與受體結(jié)合可導(dǎo)致蛋白激酶B磷酸化、肌動(dòng)蛋白形成和細(xì)胞骨架重構(gòu)，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移做好準(zhǔn)備〔14〕。MAPK/ERK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化及遷移等多種生理過程中起關(guān)鍵作用，研究表明〔15〕，使用PD抑制MAPK/ERK信號(hào)通路可下調(diào)VEGF表達(dá)，抑制腫瘤血管生成。并且已有證據(jù)表明〔16，17〕，激活MAPK/ERK信號(hào)通路可上調(diào)IL-8表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞遷移；抑制ERK1/2磷酸化則減少IL-8的產(chǎn)生。本研究以100 ng/ml IL-8增強(qiáng)HUVECs細(xì)胞的遷移能力和VEGF和p-ERK1/2蛋白表達(dá)能力；加入PD可顯著抑制IL-8誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞遷移和VEGF表達(dá)。

姜黃為姜科，屬多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)廣東、福建、云南等地，以根莖入藥可用于治療跌打損傷、胸腹脹痛、月經(jīng)不調(diào)等癥；CUR是姜黃的主要活性成分，可用于心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等多種慢性病的治療〔18，19〕。據(jù)報(bào)道〔20〕，CUR可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移，抑制血管生成和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性對(duì)乳腺癌、肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤發(fā)揮抑制作用。Yang等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，CUR能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白B1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、VEGF等蛋白表達(dá)，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和腫瘤血管生成；Yoysungnoen等〔22〕使用CUR治療肝癌異種移植模型小鼠后，其血管生成標(biāo)志物環(huán)氧化酶-2和血清VEGF水平顯著降低，新生毛細(xì)血管密度顯著降低。血管生成在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，而血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移是新生血管形成的基礎(chǔ)；血管細(xì)胞向外遷移并在新生組織中增殖，形成新的血管網(wǎng)，為新生組織提供血液供應(yīng)〔23，24〕。研究證實(shí)〔25〕，姜黃素能夠延緩乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)，降低VEGF表達(dá)并減少血管生成。本研究顯示CUR可明顯抑制IL-8誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞遷移。