腦-腸軸參與β-細(xì)辛醚和丹皮酚治療腦梗死的過(guò)程

肖敏，張琦，田博，范清雨

腦梗死是由于動(dòng)脈阻塞或狹窄引起血流中斷，進(jìn)而發(fā)生腦組織壞死[1]。腦-腸軸是將胃腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系起來(lái)的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，已證明其為多種腦血管病的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制[2]，但腦-腸軸在腦梗死病理過(guò)程中的作用及機(jī)制還甚少報(bào)道。膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）是從空腸中提取的膽囊收縮因子，為經(jīng)典腸道激素肽之一[3]。研究表明，除在胃腸道外，CCK 還分布于內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)元和上皮細(xì)胞，因此CCK 已被確定為腦-腸軸的主要成分，參與腦梗死的病理過(guò)程[4]。β-細(xì)辛醚是石菖蒲的主要成分，其可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的腦自噬[5]。丹皮酚是牡丹皮的主要成分之一，可通過(guò)抑制β分泌酶活性和細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)記憶并減輕腦缺血性損傷[6]。本研究通過(guò)建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，來(lái)探討β-細(xì)辛醚和丹皮酚對(duì)缺血再灌注后腦-腸軸的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD 大鼠15 只，購(gòu)自西安交通大學(xué)，許可證號(hào)為SYXK(陜)2015-002，體質(zhì)量（250±30）g，自由飲食飲水。將所有動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組和治療組，每組各5只。

1.1.2 主要試劑及材料 β-細(xì)辛醚和丹皮酚（購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，純度99%），Primer Script RT Master Mix kit（購(gòu)于大連Takara 公司），SYBR Select Master Mix kit（購(gòu)于上海碧云天公司），促腎上腺 皮質(zhì) 激素（adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH）ELISA 試劑盒（購(gòu)于上海Novus Biologicals公司）。

1.2 方法

1.2.1 MCAO 模型的建立 采用Zea Longa[7]線栓法對(duì)模型組和治療組大鼠建立MCAO 模型。待缺血2 h后緩慢退出尼龍線，使血流再灌注24 h。假手術(shù)組不造成缺血，其余同模型組。

1.2.2 β-細(xì)辛醚和丹皮酚的治療 在建模前7 d，治療組大鼠每天給予34 mg/kg β-細(xì)辛醚灌胃[8]及30 mg/kg 丹皮酚腹腔注射[9]，每天各1 次，連續(xù)7 d。末次給藥后2 h進(jìn)行MCAO手術(shù)造模。假手術(shù)組和模型組在相同時(shí)間點(diǎn)依照各自的給藥方式給予生理鹽水。模型組大鼠在建模時(shí)1只死亡。采用神經(jīng)功能評(píng)分及TTC染色評(píng)價(jià)是否造模成功。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 造模成功后6 h，采用Zea Longa[7]法對(duì)各組大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估。無(wú)神經(jīng)功能缺陷為0分，左前爪不能完全伸展為1分，向左旋轉(zhuǎn)為2分，在行走期間向左傾倒為3分，昏迷為4分，死亡為5分。評(píng)分1～4分表示造模成功。神經(jīng)功能評(píng)估后，大鼠經(jīng)麻醉處理，收集血液樣本，提取血清，并立即分離腦組織和腸黏膜，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 TTC染色 腦組織進(jìn)行輕度冰凍，然后沿冠狀面用刀片切成5 塊，每塊厚約2 mm，將切片置于含2%TTC 的0.2 mol/L 的PBS 溶液中，37 ℃避光孵育30 min，PBS 洗3 次，最后在4%的多聚甲醛中浸泡過(guò)夜。拍照觀察梗死灶的情況，梗死體積采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 采用TriZol試劑從各組大鼠的腸黏膜及腦梗死區(qū)中提取總RNA，用Primer Script RT Master Mix kit合成cDNA 第一鏈，之后采用SYBR Select Master Mix kit 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。GAPDH 為內(nèi)參。采用2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：CCK：上游：5’-GCACTGCTAGCCCGATACAT-3’，下游：5’- CCGAAATCCATCCAGCCCAT-3’；GAPDH：上游：5’-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3’，下游：5’-GATGGTGATGG GTTTCCCGT-3’。

1.2.6 ELISA 按照說(shuō)明書(shū)采用ACTH ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清中ACTH的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，單因素方差分析及LSD多重比較進(jìn)行組間差異分析，Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分和梗死體積的的對(duì)比

模型組和治療組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和梗死體積均高于假手術(shù)組，治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組腦切片TTC染色結(jié)果觀察

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及梗死體積的對(duì)比（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及梗死體積的對(duì)比（±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組治療組只數(shù)5 4 5神經(jīng)功能評(píng)分/分0.38±0.11 4.42±0.19①2.15±0.20①②梗死體積/mm3 53.46±8.71 237.29±15.34①96.50±10.18①②

2.2 各組梗死區(qū)和腸黏膜中CCK mRNA表達(dá)的對(duì)比

模型組和治療組大鼠梗死區(qū)和腸黏膜中CCK mRNA 的表達(dá)均高于假手術(shù)組，治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠CCK mRNA表達(dá)的對(duì)比（±s）

表2 各組大鼠CCK mRNA表達(dá)的對(duì)比（±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組治療組只數(shù)5 4 5梗死區(qū)0.22±0.10 0.69±0.18①0.52±0.14①②腸黏膜0.64±0.21 1.37±0.29①1.08±0.25①②

2.3 各組血清中ACTH含量的對(duì)比

假手術(shù)組、模型組和治療組大鼠血清ACTH 含量分別為（3.52±0.74）ng/mL、（6.22±1.10）ng/mL、（4.69±0.88）ng/mL，模型組和治療組大鼠血清ACTH含量均高于假手術(shù)組，治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 ACTH與CCK mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

模型組中，血清ACTH 含量與梗死區(qū)及腸黏膜中CCK mRNA 表達(dá)均呈顯著正相關(guān)（r=0.916，P=0.012；r=0.885，P=0.030）。

3 討論

腦梗死的病理機(jī)制較復(fù)雜，嚙齒類(lèi)動(dòng)物的MCAO模型由于操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，已被廣泛應(yīng)用于腦梗死致病過(guò)程的研究[10]。本研究結(jié)果顯示，MCAO術(shù)后大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分及梗死體積顯著增加，提示大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，經(jīng)β-細(xì)辛醚和丹皮酚干預(yù)后，大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分及梗死面積顯著降低，提示β-細(xì)辛醚和丹皮酚干預(yù)可修復(fù)受損的神經(jīng)功能，但其修復(fù)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

CCK為腸道激素之一，其除作為消化系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子外，還作為生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、精子活力因子、抗炎因子和心臟標(biāo)志物等參與多種器官的各種生理和病理過(guò)程。CCK 可誘導(dǎo)神經(jīng)元和上皮細(xì)胞等合成及釋放神經(jīng)遞質(zhì)CCK-8和CCK-5，已有研究檢測(cè)到CCK-8在腦出血和腦梗死患者中表達(dá)[11]。由此可見(jiàn)，CCK 不僅在人體多種器官中均有分布，而且還通過(guò)多種途徑參與腦梗死的生理病理過(guò)程。本研究顯示，MCAO術(shù)后大鼠腦梗死區(qū)及腸黏膜中CCK的表達(dá)顯著降低，且經(jīng)β-細(xì)辛醚和丹皮酚干預(yù)后，梗死區(qū)及腸黏膜中CCK的表達(dá)顯著增加。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)胃腸道的調(diào)節(jié)主要是內(nèi)、外刺激經(jīng)中樞整合后由神經(jīng)或神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)下穿至腸道神經(jīng)叢或直接作用于胃腸細(xì)胞[12]，因此筆者推測(cè)腦-腸軸中CCK表達(dá)的降低可能與腦梗死發(fā)病有密切關(guān)系。

腦-腸軸通過(guò)分泌一些神經(jīng)遞質(zhì)（如CCK），在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)以及胃腸道效應(yīng)細(xì)胞之間進(jìn)行傳遞，調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺(jué)、分泌及運(yùn)動(dòng)，這類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)稱(chēng)為腦腸肽。腦腸肽不僅參與胃腸道的調(diào)節(jié)，還參與下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸、交感和副交感神經(jīng)的激活過(guò)程，進(jìn)而廣泛參與神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)。腦梗死作為一種應(yīng)激因素作用于下丘腦，使HPA 軸功能亢進(jìn)，進(jìn)一步導(dǎo)致腦病理變化，加重病情[13]。ACTH 是由丘腦下部室旁核的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）刺激分泌的，在HPA 軸參與腦梗死的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。當(dāng)大面積腦梗死時(shí)，顱內(nèi)形成占位性病變效應(yīng)導(dǎo)致垂體前葉受壓、壞死，引發(fā)垂體分泌激素，ACTH 等大量流入血液[14]。本研究顯示，模型組中血清ACTH的含量與腦腸軸CCK的表達(dá)呈正相關(guān)，這些結(jié)果提示腦梗死損傷導(dǎo)致梗死區(qū)及腸粘膜中CCK 的表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致HPA軸功能亢進(jìn)，進(jìn)一步加重病情。垂體分泌的ACTH大量流入血液即為HPA 軸功能亢進(jìn)的標(biāo)志。而β-細(xì)辛醚和丹皮酚干預(yù)可降低腦-腸軸CCK的表達(dá)，降低血清ACTH的含量，提示β-細(xì)辛醚和丹皮酚可通過(guò)抑制腦-腸軸中CCK 表達(dá)，抑制HPA 功能亢進(jìn)，進(jìn)而改善腦梗死。但β-細(xì)辛醚和丹皮酚對(duì)腦-腸軸中CCK表達(dá)的調(diào)控機(jī)制還不清楚，對(duì)下丘腦和腸黏膜中相關(guān)蛋白的作用機(jī)制也還不清楚，這將是本課題下一步要開(kāi)展的項(xiàng)目。