革蘭陰性菌孔蛋白結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用的研究進展

汪德會，李 攀，李能章，彭遠義

（西南大學 動物科技學院，重慶 400715）

革蘭陰性菌（Gram-negative bacteria）的外膜是一種由蛋白質(zhì)、脂多糖、磷脂等多種物質(zhì)組成的復合結(jié)構(gòu)，約占細胞壁干重的80%，是革蘭陰性菌抵抗外來有毒化合物的第一道防線?？椎鞍祝≒orins）是外膜蛋白（OMPs）家族中的一類典型膜通道蛋白，1979 年Nakae 第一次描述了它的特征并將其命名為孔蛋白?？椎鞍椎慕Y(jié)構(gòu)在莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulatus）中首次得到了精準解析[1]，這類蛋白質(zhì)參與了多種營養(yǎng)物質(zhì)和有毒小分子（糖、藥物、小肽、化學物質(zhì))的運輸。此外，孔蛋白可誘導宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答、參與細菌的耐藥和補體活化等，并可作為新型疫苗候選靶標和免疫佐劑[2-3]。本文從孔蛋白的分子結(jié)構(gòu)、在細菌感染和耐藥中的作用以及作為疫苗佐劑研究等予以綜述，為了解細菌的耐藥機制以及研發(fā)新的疫苗提供參考。

1 孔蛋白的分子結(jié)構(gòu)

孔蛋白貫穿于細菌外膜的磷脂雙分子層，在其外表面形成一富含水的通道，通常僅允許小于0.6 ku 的親水性小分子通過。革蘭陰性菌孔蛋白有單體和三聚體兩種結(jié)構(gòu)。

經(jīng)典的孔蛋白是由三個單體聚合而成的三聚體結(jié)構(gòu)，單體之間由L2 環(huán)（Loop）連接，每個單體由300～420 個氨基酸構(gòu)成，其N 端有由21 個氨基酸組成的信號肽序列，其C 端有一個苯丙氨酸殘基，該殘基是孔蛋白正確導入外膜并在其中折疊的重要前提[4]。經(jīng)典孔蛋白分為非特異孔蛋白（General or Non-specific porins）（如OmpF、PhoE 和OprP）和底物特 異 孔 蛋 白（Substrate specific porins）（如LamB 和ScrY）兩類，這兩類蛋白的單體分別由16 和18 條反平行的肽鏈折疊成一個β桶（β barrel）狀結(jié)構(gòu)，孔徑的最大橫徑在30 ?～35 ?之間，最大高度約為50 ?[5-6]。每個單體鏈在周質(zhì)內(nèi)側(cè)以7 或8 條短環(huán)連接，在細胞外側(cè)則以不規(guī)則的9 或7 條長環(huán)連接，最長的L3 環(huán)并不在胞外側(cè)暴露而是在桶內(nèi)通道高度的一半處折疊形成收縮區(qū)，在該收縮區(qū)內(nèi)，L3 環(huán)中的酸性殘基（Asp-113、Glu-117）和與之相對筒體壁中的一簇堿性殘基（Lys-16、Arg-42、Arg-82、Arg-132）形成了較強的橫向靜電場，對孔隙的滲透性起著決定性的作用[7]（圖1）。L3 環(huán)含有一個序列基序—PEFGG，在大腸桿菌孔蛋白（OmpF）中高度保守，該基序構(gòu)成了L3 環(huán)中最柔性的區(qū)域，使L3 環(huán)在孔徑內(nèi)有局部運動的可能性。底物特異孔蛋白與非特異孔蛋白不同的是，長環(huán)L1 也能在桶內(nèi)折疊，與L3 環(huán)共同決定孔徑的大小，并且外環(huán)通常聚合形成一個保護傘，起著保護孔徑和限制大分子物質(zhì)進入孔隙的作用，這可能與底物特異性結(jié)合相關(guān)[8]。

單聚體孔蛋白與三聚體孔蛋白的單體結(jié)構(gòu)類似，一般由8、12 或14 條肽鏈β折疊而成，因其孔隙內(nèi)缺少像三聚體孔蛋白L3 環(huán)類似的收縮區(qū)結(jié)構(gòu)，使得其孔徑比經(jīng)典的孔蛋白單體大；其孔徑一般為橢圓狀，單側(cè)在鏈S6～S10 處稍扁[7]。大腸桿菌單聚體孔蛋白（OmpG）構(gòu)型受pH 值的影響，在中性pH下， L6 和L7 環(huán)投射到細胞外介質(zhì)中，使孔洞打開，而在低pH 下，其在孔道內(nèi)折疊并阻塞孔道[9]（圖2）。

圖1 大腸桿菌三聚體孔蛋白OmpF 的結(jié)構(gòu)[8]

圖2 大腸桿菌單體孔蛋白OmpG 的結(jié)構(gòu)，A、B 和C、D 分別為孔徑開放和關(guān)閉狀態(tài)[9]

2 孔蛋白在細菌感染中的作用

2.1 孔蛋白介導的信號通路轉(zhuǎn)導及免疫反應(yīng)

孔蛋白是細菌外膜重要的組成成分，在細菌感染宿主的過程中，孔蛋白可黏附侵入不同類型的組織細胞，刺激宿主細胞產(chǎn)生一系列促炎因子、抗炎因子和趨化因子，并誘導下游效應(yīng)細胞的成熟與分化，從而增強細胞表面MHC 分子以及共刺激分子（Co-stimulatory molecules）的表達，在天然免疫和獲得性免疫中起著重要的作用。

孔蛋白的特異受體目前尚不明確，但其作為病原相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）能 被Toll 樣 受 體（Toll-like receptor，TLR）或其它模式識別受體（Pattern-recognition receptors，PRRs）所識別而發(fā)揮作用[3]（圖3）。TLR 廣泛表達于多種組織和細胞，其中TLR2 是TLR 家族中功能較多、識別譜最廣的受體之一，在天然免疫中起著重要的作用。大量研究表明，許多革蘭氏陰性菌孔蛋白均能被TLR2 或其它受體分子識別，使免疫細胞活化，誘導炎癥反應(yīng)。例如，腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）孔蛋白PorB 能被TLR2 識別，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴途徑、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（Nuclear factor κB，NF-κB）通路誘導抗原遞呈細胞（Antigen presenting cell，APC）的活化、增強MHC Ⅱ和CD86分子的表達、并誘導B細胞增殖和樹突狀細胞（DCs）的成熟，可在天然免疫與獲得性免疫中起著橋梁的作用[10-11]。研究顯示，PorB 可直接與TLR2 結(jié)合，在TLR6 敲除小鼠內(nèi)誘導B 細胞分泌高水平的IL-6，而在TLR1 敲除小鼠內(nèi)使B 細胞分泌IL-6 的能力明顯減弱，表明PorB 誘導細胞的活化需要TLR2/TLR1（而不是TLR2/TLR6）異源二聚體進一步來發(fā)揮其生物學效應(yīng)[12]。此外，痢疾桿 菌（Shigella dysenteriae）MOMP、流 感 嗜 血 桿 菌（Haemophilus influenzae）Hib 以及具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）FomA 等孔蛋白也能被TLR2 識別，誘導相應(yīng)免疫細胞的活化，促使發(fā)生一系列免疫反應(yīng)[13-15]。

孔蛋白除了能被TLR2 識別之外，也能通過其它信號途徑或方式誘導免疫反應(yīng)。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar typhimurium）34 ku 和36 ku孔蛋白能在不同的組織細胞中通過相似或不同的信號通路誘導炎癥因子、共刺激分子的表達。其中，這兩種蛋白在小鼠巨噬細胞（RAW 264.7）中通過P38 和JNK MAPK 通路誘導一氧化氮分子（NO）的分泌[16]，在人白血病單核細胞（U937）中可通過Raf-1-MEK1-MEK2-MAPK 通路活化NF-κB 和AP-1，以及誘導蛋白酪氨酸激酶（NT-PTK）、蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）磷酸化并促使TNF-α 、IL-1β 、IL-6 和IL-10 的分泌[17-18]。此外，這兩種蛋白在小鼠脾細胞模型中活化CD4+T 細胞并促進IFN-γ和IL-4的分泌，在人外周淋巴細胞（Human PBMCs）中可誘導CD80 和CD86 的表達[19]。流感嗜血桿菌孔蛋白P2中的L5、L6 和L7 環(huán)也能激活JNK 和P38 MAPK 通路促進IL-6 和TNF-α的分泌，表明孔蛋白細胞的外側(cè)環(huán)可發(fā)揮生物學活性作用[20]。

圖3 革蘭陰性菌孔蛋白介導的信號轉(zhuǎn)導及免疫反應(yīng)[3]

2.2 孔蛋白參與補體的激活

補體系統(tǒng)（Complement system）是存在于人和動物血液、組織液和細胞膜表面的一種復雜的限制性蛋白水解系統(tǒng)，是機體固有免疫防御體系的重要組成部分，可參與病原微生物的防御和免疫調(diào)節(jié)。研究表明部分革蘭陰性菌孔蛋白可與補體C1q 結(jié)合，通過經(jīng)典途徑激活補體。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）孔蛋白II 能與C1q 結(jié)合，并以非抗體依賴方式激活補體經(jīng)典途徑，然后酶解C4 并降低血清總?cè)苎钚訹21]。肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae）孔蛋白OmpK36 通過與C1q 結(jié)合激活體內(nèi)經(jīng)典補體途徑，并使C3、C5-9（MAC）成分在孔蛋白中沉積[22]。淋球菌孔蛋白Por1B 通過酰胺鍵和酯鍵選擇性結(jié)合補體結(jié)合蛋白C4b 和C3b，促使C5 轉(zhuǎn)化酶的形成[23]。Mishra M 等研究顯示體外重組表達的銅綠假單胞菌孔蛋白OprF 可與補體C3b 結(jié)合，同時增加補體介導的殺菌效應(yīng)[24]。

3 孔蛋白在細菌耐藥中的作用

革蘭陰性菌目前占耐藥細菌的主導部分，隨著抗菌藥物的使用增多，其耐藥復雜性也隨之增加，給臨床用藥以及細菌疾病的防治帶來了巨大的挑戰(zhàn)?？椎鞍资羌毦饽て琳系闹匾煞?，一個細胞擁有孔蛋白的數(shù)量和類型將決定其滲透性，從而決定細菌對抗生素的敏感或耐藥性。目前認為，孔蛋白表達量的變化、基因突變（點突變、缺失突變、插入元件）等均會引起細菌外膜通透性降低而引起細菌耐藥[25-26]。

3.1 孔蛋白基因突變與細菌耐藥

大量研究表明，孔蛋白的缺失可導致細菌耐藥。Hao 等從臨床分離了18 株耐碳青霉烯酶（Carbapenems）的產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），其中14 株有耐碳青霉烯酶基因（blaKPC-2）的存在，對這14 株耐藥菌株進行SDS-PAGE 分析，發(fā)現(xiàn)有兩株（A4 和A23）缺失孔蛋白Omp35，兩株（A18 和A19）孔蛋白Omp36 的表達下降；而對這4 株孔蛋白缺陷菌株的功能恢復后發(fā)現(xiàn)其對碳青霉烯類藥物的最小抑菌濃度（MIC）降低了2～4 倍，表明孔蛋白Omp35和Omp36 缺失或表達減少會引起產(chǎn)氣腸桿菌對碳青霉烯酶藥物的耐藥[27]。另外，Zhen 等從214 株產(chǎn)KPC 的肺炎克雷伯菌（KPC producing Klebsiella pneumonia，KPC-KP）中篩選出了24 株耐頭孢他啶（Ceftazidime）菌株，根據(jù)最小抑菌濃度將其分為高、中、低三組，用ELISA 和RT-PCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)高MIC 組菌株的頭孢他啶水解酶活性以及耐藥基因（blaKPC）的轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于其它兩組，同時SDS-PAGE 結(jié)果顯示MIC＞1 mg/mL 的所有菌株孔蛋白OmpK35 均缺失，而在敏感菌株中孔蛋白OmpK35和OmpK36 均存在；測序分析顯示，由于孔蛋白基因存在移碼致使轉(zhuǎn)錄提前終止（n=15）以及孔蛋白負調(diào)控基因micF 和ompR 的過表達導致OmpK35 缺失，表明孔蛋白缺失并伴有抗菌藥物的水解酶表達增加時，可加重細菌的耐藥[28]。

此外，孔蛋白基因點突變和插入元件（IS）也能引起細菌耐藥。Emmanuelle Dé等首次描述腸桿菌（Enterobacteriaceae）孔蛋白L3 環(huán)中第112 位氨基酸由G 突變?yōu)镈 可改變該蛋白的功能從而導致該菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥[29]。同樣地，淋病奈瑟菌孔蛋白PIB L3 環(huán)基因突變同時伴隨mtrR 突變導致外排泵（Efflux pump）過表達時可導致該菌對青霉素和四環(huán)素耐藥[30]。Diene S M 等從一名沒有接受碳青霉烯類藥物治療的囊性纖維化（CF）患者身上分離了6 株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其中有5 株對亞胺培南（Imipenem）耐藥，1 株敏感。在這6 株菌中均未檢測到碳青霉烯酶耐藥基因以及碳青霉烯酶活性，PCR 和測序顯示耐藥菌株（n=5）孔蛋白基因porD 中均存在插入序列ISPa46，而敏感菌株（n=1）存在的插入序列ISPa46 并未插入到porD 基因中，表明其耐藥原因與碳青霉烯酶無關(guān)，而是孔蛋白oprD基因中插入ISPa46 發(fā)生轉(zhuǎn)位導致耐藥[31]。臨床中耐藥細菌可能同時存在耐藥基因和孔蛋白基因突變，這些耐藥因素的疊加作用致使耐藥情況更加復雜化。

3.2 孔蛋白表達水平與細菌耐藥

細菌可以在不利于其生存的環(huán)境通過調(diào)控自身基因的表達來抵抗外來因素的威脅。研究顯示，細菌孔蛋白的表達減少可導致細菌耐藥。Lee J Y 等從357 株腸桿菌中篩選了31 株耐亞胺培南菌株，通過多位點序列（MLST）和ERIC-PCR 分析顯示這些菌株的遺傳關(guān)系較遠，并且在大多數(shù)耐藥菌株（n=29）中均不存在亞胺培南耐藥基因，同時其孔蛋白ompD和ompK35 基因的表達水平均下降；表明亞胺培南抗性似乎在大多數(shù)亞胺培南耐藥菌株中均是獨立發(fā)生的，而孔蛋白表達減少是導致亞胺培南敏感性降低的主要原因[32]。此外，非藥物特異孔蛋白表達增加時會影響細菌外膜通透性，從而導致細菌對某一類藥物敏感或耐藥。Anuwat A 等研究顯示伯克霍爾假單胞菌（Burkholderia pseudomallei，Bps）表達孔蛋白BpsOmp38 的菌株比對照菌株的抗菌敏感性更低，同時脂質(zhì)體腫脹試驗顯示，Bps 耐藥的藥物（頭孢西丁、頭孢吡肟和多瑞培南）并不能通過BpsOmp38 通道，Bps 敏感的藥物頭孢他啶和美羅培南卻與此相反；此外，編碼BpsOmp38 基因的氨基酸Tyr119 被Ala119 取代時有利于Bps 對抗菌藥物的吸收，而被Phe119 取代時則可抑制Bps 對抗菌藥物的吸收；表明BpsOmp38 是一個特異性孔蛋白并與膜通透性相關(guān)，而殘基Tyr119 的替代影響了BpsOmp38 通道對中性糖和抗菌藥物的吸收[33]。

4 孔蛋白作為疫苗候選靶標和免疫佐劑

孔蛋白作為一類膜通道蛋白暴露于革蘭陰性菌表面，具有高度的免疫原性，可作為疫苗候選靶標及活性佐劑。Yadav 等將40 ku 嗜水氣單胞菌孔蛋白OmpF 腹腔免疫小鼠，在49 d 后還能檢測到很高的免疫球蛋白IgG 滴度，同時發(fā)現(xiàn)該蛋白的抗血清能同時與不同親水性的氣單胞菌反應(yīng)；此外，該蛋白在體外能夠促進小鼠淋巴細胞的增殖和T 細胞分泌IL-4 和IFN-γ[34]。而將同菌株孔蛋白Omp48 免疫鯪魚，該蛋白可對鯪魚針對同一菌株和遲緩型愛德華菌（Edwardsiella tarda）提供60%～70%的抗感染能力，表明OmpF 和Omp48 有作為疫苗抗原的潛質(zhì)[35]。Li等研究顯示，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的孔蛋白VP1061 和VP2850 對魚和小鼠針對溶藻弧菌（V.alginolyticus）、嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的感染具有交叉抵抗能力，而有望成為新型多價疫苗[36]。Tan 等將B型多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）孔蛋白OmpH 分別皮下和腹腔注射免疫小鼠，該蛋白可對小鼠針對同型Pm 菌株分別提供80%和100%的抗感能力；而本實驗室將A 型Pm OmpH 與PM0979 融合表達免疫小鼠，該融合蛋白可對小鼠針對A 型和B 型Pm 分別提供70%和30%的抗感染能力[37-38]。另外，奈瑟菌屬孔蛋白PorB 作為TLR2 的激動劑已成為佐劑的研究熱點，其誘導APCs 的活化以及下游效應(yīng)分子的表達必須依賴完整的MyD88 信號分子[11]。其中Liu 等用Nlac PorB 作為佐劑并以卵清蛋白（OVA）作為標準抗原免疫小鼠，與單獨免疫卵清蛋白相比，可誘導小鼠產(chǎn)生高滴度、OVA 特異的IgG 和IgM，與用Nme-PorB 和鋁膠佐劑免疫小鼠產(chǎn)生的抗體滴度相同，并可促進炎性因子IL-4、 IL-10、IL-12 和INF-γ的分泌，以及誘導Th1 和Th2 型免疫反應(yīng)[39]。最近研究顯示，PorB 可誘導小鼠分泌與Th2/Th1 型反應(yīng)相關(guān)的OVA 特異性抗體IgG1、IgG2b、IgG2c 和IgG3 以 及效應(yīng)分子MIG、MCP-1、IP-10、MIP-1、CXCL1 和IL-2，同時促進T 細胞分泌IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ；PorB 佐劑疫苗還能促進抗原特異性的CD4+T 和CD8+T 細胞的增殖，同時能降低小鼠在單增李斯特菌低劑量感染時的定殖，提高在高劑量感染時的存活率[40]。表明以TLR2配體為主的奈瑟菌孔蛋白PorB 具有廣泛的佐劑和抗原活性，可用于疫苗佐劑研發(fā)。

5 小結(jié)與展望

孔蛋白有單聚體和三聚體兩種結(jié)構(gòu)，其可通過激活補體、作為PAMPs 識別TLR2、通過膜通透性變化等參與細菌的致病過程，同時其本身可作為疫苗候選靶標和佐劑（表1）?？椎鞍譒3 環(huán)在胞內(nèi)折疊形成收縮區(qū)，以限制大分子物質(zhì)進入胞內(nèi)，并且L3環(huán)基因突變可導致細菌耐藥[29]，深入探究L3 環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能有助于了解細菌的耐藥機制，同時為臨床研發(fā)小分子量、靶向細胞外的一類藥物以減少耐藥細菌的產(chǎn)生提供參考。然而，細菌的耐藥除與細胞膜通透性有關(guān)外，還與耐藥基因、細菌水解酶的多少以及用藥情況息息相關(guān)，這為臨床用藥帶來了極大的挑戰(zhàn)[2]。佐劑是疫苗的重要組成部分,安全有效的佐劑能夠提高疫苗的免疫效果，TLR激動劑已廣泛用于人和動物的疫苗生產(chǎn)，例如瘧疾、HIV、結(jié)核、癌癥等許多疑難疾病的疫苗也加入了這些佐劑[41]。研究孔蛋白的TLR2 激動劑效應(yīng)可為臨床疫苗研發(fā)的多樣性提供新的可能。因此，深入研究孔蛋白的分子結(jié)構(gòu)以及與宿主的相互作用，有利于了解細菌的耐藥和致病機制，同時為開發(fā)針對細菌病的新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

表1 革蘭陰性菌孔蛋白結(jié)構(gòu)及功能應(yīng)用