一株鴨源維氏氣單胞菌的分離鑒定與致病性的初步研究

蘇 湘，仲 艷，王希玉，秦 濤，陳素娟*，彭大新

（1. 揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225000）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，A. veronii）廣泛存在于水體和土壤中，絕大多數(shù)菌株是動(dòng)物腸道與自然生態(tài)系統(tǒng)的正常菌群[1]，而一些致病性菌株，是較為新型的人-獸-水生生物共患病原菌，近年來，感染A.veronii 的病例報(bào)道越來越多，可以引起多種魚類如錦鯉、羅非魚等大量死亡[2]，也可感染一些特殊的水生生物，如大鯢[3]等，偶爾也會(huì)感染恒溫動(dòng)物，如狐貍感染后會(huì)出現(xiàn)劇烈腹瀉，重者死亡[4]；兔感染后出現(xiàn)呼吸道疾病臨床癥狀[5]；人類感染后會(huì)出現(xiàn)毒血癥[6]、心內(nèi)膜炎[7]等癥狀，尤其是免疫力低下的人群，一旦感染將有死亡的風(fēng)險(xiǎn)[8]。A.veronii可污染畜禽肉品、蔬菜和水產(chǎn)品等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也嚴(yán)重威脅著人類的健康[9]。

2018 年12 月，江蘇某肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)30 周齡的種鴨突然出現(xiàn)散發(fā)性死亡，病死鴨的主要病理變化表現(xiàn)為肝臟不同程度的出血壞死；心肌出血和腦充血出血等，為確診該病，進(jìn)行了病原的分離鑒定，分離到一株鴨源A.veronii，并對(duì)其生物學(xué)特性和致病性展開了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 病料樣品及主要實(shí)驗(yàn)材料 江蘇某養(yǎng)殖場(chǎng)死亡種鴨，30 周齡，大多注射部位感染；飼養(yǎng)期間未用藥，但曾注射肝炎弱毒苗、漿膜炎、禽流感、鴨瘟、坦布蘇、新城疫疫苗；細(xì)菌生化管和藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；麥康凱、LB 和血瓊脂培養(yǎng)基自行配制；綿羊全血購(gòu)自鄭州九龍生物制品有限公司。6 周齡BALB/c 小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；2 日齡健康雛鴨，購(gòu)自泰興麗佳禽業(yè)有限公司。

1.2 病鴨的解剖觀察 剖檢死亡鴨，觀察內(nèi)臟的病變，并拍照記錄。

1.3 病毒檢測(cè) 研磨病料樣品，進(jìn)行禽流感病毒、新城疫病毒及黃病毒等的檢測(cè)。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 無菌采集病鴨肝臟，分別接種于血平板、麥康凱培養(yǎng)基和LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，經(jīng)革蘭染色，鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.5 微生物質(zhì)譜儀鑒定 對(duì)分離菌進(jìn)行微生物質(zhì)譜分析，初步鑒定分離菌的種屬。

1.6 細(xì)菌的生化鑒定 挑取純化后的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，接種于微量生化反應(yīng)管，37 ℃條件下培養(yǎng)18 h～24 h，觀察反應(yīng)結(jié)果，初步鑒定分離菌的生化特性。

1.7 細(xì)菌16S rRNA 基因序列分析 通過煮沸裂解法制備細(xì)菌模板DNA，利用16S rRNA 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參考文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)引物（5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'/5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95 ℃15 s、53 ℃15 s、72 ℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)序。

1.8 藥敏試驗(yàn) 采取K-B 藥敏紙片擴(kuò)散法[11]對(duì)分離株進(jìn)行19 種常用抗生素的藥敏試驗(yàn)。參考杭州天和微生物試劑有限公司《藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》判斷該菌對(duì)不同藥物的敏感性。

1.9 雛鴨人工感染試驗(yàn) 分離菌于37 ℃血瓊脂培養(yǎng)6 h，比濁法測(cè)定菌液濃度。選取2 日齡雛鴨通過腹腔分別注射1.0×1010cfu 和1.0×1011cfu 細(xì)菌。觀察并記錄其發(fā)病死亡情況，如出現(xiàn)死亡則立即解剖。

1.10 小鼠的致病性試驗(yàn) 挑取分離純化的單菌落于血液瓊脂培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)6 h。分別通過比濁法測(cè)定菌液濃度，用15%甘油PBS 稀釋至1.0×106cfu/mL～1.0×109cfu/mL。健康小鼠隨機(jī)分為5 組，感染組4 組每組各4 只，對(duì)照組3 只。其中攻毒組于腹腔注射菌液懸液（0.5 mL/只），對(duì)照組于腹腔注射等量的15%甘油PBS。若發(fā)現(xiàn)死亡則立即解剖，并對(duì)致病菌分離鑒定，用改良寇氏法計(jì)算細(xì)菌的半數(shù)致死量（LD50）[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 死亡鴨的病理解剖 剖檢死亡鴨，肉眼可觀察到組織器官病變主要為肝臟表面顏色不均、多發(fā)性壞死灶，腦血管充血、出血，心冠脂肪及心肌出血。

2.2 病毒檢測(cè) 未檢測(cè)到相關(guān)病毒。

2.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與染色鏡檢 麥康凱和LB 培養(yǎng)基表面可見圓形菌落，其表面光滑，邊緣整齊，不透明，灰白色，中央稍凸起；血瓊脂培養(yǎng)基出現(xiàn)明顯的β溶血（圖1）。革蘭染色鏡檢可見紅色兩端鈍圓的短直陰性桿菌，多為單個(gè)或成雙存在。表明，該分離菌為β溶血陰性桿菌。

2.4 分離菌的微生物質(zhì)譜儀鑒定 微生物質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，分離菌的鑒定值為2.053，介于2.000～2.299 之間，結(jié)果對(duì)照判定標(biāo)準(zhǔn)，初步判定該分離菌屬于氣單胞菌屬。

圖1 血平板分離與培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 The results of isolation and culture in blood agar medium

2.5 分離菌生化鑒定 生化試驗(yàn)結(jié)果顯示蛋白胨水（靛基質(zhì)）、枸櫞酸鈉、賴氨酸、M-R、V-P 試驗(yàn)反應(yīng)陽(yáng)性；硫化氫、苯丙氨酸、尿素、鳥氨酸、葡萄糖鹽酸、賴氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖、氨基酸對(duì)照反應(yīng)均呈陰性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，結(jié)果顯示該菌符合A.veronii的生化特性。

2.6 16S rRNA 基因序列分析 16S rRNA 試驗(yàn)結(jié)果顯示，約1 400 bp 處出現(xiàn)特異性目的條帶（圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示，分離株的基因序列與GenBank 中已登錄的多個(gè)A. veronii 基因序列相似度均為99 %以上，表明該分離菌為A.veronii。因此，本試驗(yàn)首次從病死鴨體內(nèi)分離到了A.veronii，以往未見相關(guān)報(bào)道。

2.7 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)氟苯尼考等10 種藥物敏感，對(duì)紅霉素等6 種藥物中度敏感，對(duì)四環(huán)素等3 種藥物耐藥（表1）。通過藥敏試驗(yàn)，能準(zhǔn)確篩選出病原菌的敏感藥物，可以大幅降低抗生素用量，具有重要意義。但是部分藥物已被禁止在家禽養(yǎng)殖中使用[13]，所以選取藥物時(shí)既要考慮藥物的敏感性，又要遵循用藥的規(guī)定，因此建議選用慶大霉素、頭孢氨芐等藥物來治療疾病。

圖2 16S rRNA PCR 擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.2 PCR products of 16S rRNA gene from the strain

表1 分離菌的藥物敏感性結(jié)果Table 1 Antibiotic sensitivity test of the isolated bacteria

2.8 雛鴨人工感染試驗(yàn)結(jié)果 將分離菌制備成懸菌液，腹腔注射2 日齡雛鴨，結(jié)果表明，24 h 內(nèi)，1011cfu 組4 只雛鴨全部死亡，1010cfu組死亡3只，對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。剖檢可見腹部皮下呈膠凍樣，腸道鼓氣，腹腔炎性滲出，心肌松弛、心臟出血，肝臟出血等病變。病鴨肝臟中分離出細(xì)菌，于血平板上呈現(xiàn)明顯的β溶血，經(jīng)鑒定為A.veronii。表明A.veronii可造成雛鴨死亡。據(jù)此推測(cè)該病例中種鴨死亡的原因可能為體表傷口接觸含有A. veronii 的土壤和水源或采食感染A.veronii 的魚、蝦以及其他水生生物導(dǎo)致死亡。

2.9 小鼠致病性試驗(yàn) 菌液腹腔注射小鼠，結(jié)果表明，5.0×107cfu 和5.0×108cfu 組小鼠于腹腔注射后1 d～2 d 內(nèi)全部死亡；其余小鼠在兩周內(nèi)正常存活（表2）。通過改良寇氏法計(jì)算細(xì)菌的LD50為5.0×106.5cfu。對(duì)死亡小鼠解剖，可見肝臟、肺臟出血明顯。表明A.veronii 對(duì)小鼠有一定的致病性。李偉杰、周軍等均首次證明A.veronii 對(duì)狐貍、家兔等哺乳動(dòng)物有較強(qiáng)的致病性，與本試驗(yàn)結(jié)果相似[4-5]。

表2 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Pathogenicity of the strain to mice