熱應(yīng)激蛋白與病毒免疫應(yīng)答研究進(jìn)展

張 蕾，張培軍，郭曦堯，李月紅*

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2. 教育部動物安全生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118；3. 吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢測中心，吉林 長春 130000）

熱應(yīng)激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是生命體處于應(yīng)激狀態(tài)時機(jī)體為維護(hù)蛋白質(zhì)正常生理功能而產(chǎn)生的一類伴侶蛋白。1962 年，Ritossa 最早發(fā)現(xiàn)了熱應(yīng)激反應(yīng)[1]，隨后，Tissiere 在該反應(yīng)中成功分離到由基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)而形成的蛋白質(zhì)并將其命名為熱應(yīng)激蛋白（又名熱休克蛋白）[2]。由于熱應(yīng)激蛋白種類繁多，迄今為止尚沒有具體的分類標(biāo)準(zhǔn)，所以根據(jù)其分子量大小和主要功能，可將熱應(yīng)激蛋白大致分為幾種不同的家族，其中HSP90 家族、HSP70 家族、HSP60 家族、HSP40 等家族是熱應(yīng)激蛋白家族中研究最深入的幾類[3-4]。熱應(yīng)激蛋白作為一種重要的伴侶蛋白，其產(chǎn)生伴侶活性的方式是在正常生理狀況或應(yīng)激狀態(tài)下參與多肽在體內(nèi)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)防止蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤的折疊和聚集[5]。而當(dāng)生命體受到外界脅迫時，熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)模式會從基因水平上開始發(fā)生改變，形成的熱應(yīng)激蛋白可以識別變性蛋白的疏水區(qū)域，阻止變性蛋白發(fā)生不可逆折疊，使細(xì)胞從環(huán)境脅迫中得到恢復(fù)，保護(hù)細(xì)胞降低或免受應(yīng)激傷害[6-7]。

熱應(yīng)激蛋白不僅在胚胎發(fā)育、信號傳導(dǎo)、抗氧化、抗應(yīng)激抗細(xì)胞凋亡等方面有明顯的調(diào)節(jié)功能，在協(xié)同免疫方面也發(fā)揮著重要作用[8-9]。有些觀點(diǎn)認(rèn)為病毒通過侵占伴侶蛋白從而促進(jìn)其在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖。而Guan 等提出流感病毒是利用細(xì)胞伴侶這一途徑來逃避宿主防御而不是利用它們來促進(jìn)病毒的傳播[10]。也有許多學(xué)者對熱應(yīng)激蛋白參與機(jī)體抗病毒感染免疫效應(yīng)方面進(jìn)行了相關(guān)研究，證實(shí)熱應(yīng)激家族成員在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮了重要作用，其參與了病毒的穿入[11]，脫殼[12]、復(fù)制[13]、基因表達(dá)[14]、組裝[15]和病毒粒子釋放等病毒復(fù)制周期的不同階段。病毒的侵染促進(jìn)了動植物寄主或病毒自身基因組表達(dá)熱應(yīng)激蛋白，產(chǎn)生的熱應(yīng)激蛋白可與病毒蛋白結(jié)合在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，而病毒侵入也可改變熱應(yīng)激蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布形式[16-17]。本文對熱應(yīng)激蛋白在病毒誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中的作用進(jìn)行綜述，旨在為動植物病毒病的預(yù)防及治療提供新的解決方法和思路。

1 熱應(yīng)激蛋白HSP70 家族抗病毒侵染作用

HSP70 家族是熱應(yīng)激蛋白家族中最為保守的一類蛋白，也是研究最為深入的蛋白。非致死的HSP70 在人類、動物機(jī)體的一些疾病治療、粘膜保護(hù)、抗腫瘤治療等方面均具有十分重要的作用[18]。HSP70 在正常情況下表達(dá)量較少只有在應(yīng)激刺激下表達(dá)才會顯著升高，主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解調(diào)控過程，提高細(xì)胞耐受性維持細(xì)胞正常生理功能。研究表明，HSPs 可通過復(fù)制酶互作促進(jìn)DNA 或RNA 病毒的復(fù)制，病毒也可上調(diào)寄主HSPs 水平[19]。如蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒、水稻條紋病毒等的侵染可提高番茄、煙草、水稻等寄主植物HSP70或熱休克同源蛋白70 的豐度[20]。Swindell 等采用ATH1 微陣列平臺，通過改變不同外界條件（包括病原刺激）作用擬南芥發(fā)現(xiàn)，高溫、病原等對其嫩枝、葉片HSP70 表達(dá)均具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用[21]。動物實(shí)驗(yàn)證明病毒感染可直接誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)HSP70 蛋白的大量表達(dá)，過表達(dá)的HSP70 與病毒蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，遞呈病毒蛋白抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗病毒的免疫應(yīng)答。已有大量文獻(xiàn)表明HSP70 蛋白可以作為潛在的抗病毒作用靶點(diǎn)。Lahaye 等通過抑制HSP70 蛋白發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒表達(dá)量顯著減少，在感染細(xì)胞中純化的核衣殼和純化的病毒粒子中檢測到HSP70 的存在，證明HSP70 蛋白可能參與了狂犬病病毒復(fù)制周期的某個階段[22]。Taguwa 等通過免疫共沉淀和免疫印跡等方法驗(yàn)證了登革熱病毒復(fù)制時在不同細(xì)胞里的不同步驟需要不同的熱應(yīng)激蛋白酶（DNAJ）輔助因子，HSP70 和DNAJ 在登革熱病毒進(jìn)入中發(fā)揮作用，HSP70 和DNAJB11 作用在病毒RNA合成時，HSP70 和DNAJB6 作用在病毒粒子產(chǎn)生過程中[23]。Hafrén 等研究表明HSP70 及其協(xié)同伴侶分子具有調(diào)控病毒蛋白外殼的功能，進(jìn)而干擾病毒基因的表達(dá)[24]。潘穎等利用RNA 干擾（RNAi）技術(shù)特異性降低HepG2.2.15 細(xì)胞中HSP70 的表達(dá)量，結(jié)果顯示細(xì)胞中乙型肝炎病毒DNA 含量和相關(guān)抗原（HBsAg）的分泌量顯著降低，進(jìn)一步說明HSP70 在病毒的生命周期中發(fā)揮重要功能[25]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而自我調(diào)整的一個主動的過程，是受基因調(diào)控的死亡過程。而熱應(yīng)激蛋白作為分子伴侶在細(xì)胞的新陳代謝中同樣發(fā)揮了重要的作用，已有大量報道證明熱應(yīng)激蛋白參與細(xì)胞凋亡機(jī)制，是機(jī)體細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素之一。Schmitt 等對人類白細(xì)胞的研究表明HSP70 抑制細(xì)胞凋亡從而增加暴露于各種致死刺激的細(xì)胞的存活率[26]。張育等研究表明HSP70 過表達(dá)能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活，抑制細(xì)胞的凋亡[27]。綜上所述，HSP70 家族通過激活機(jī)體免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞抗逆性等方式協(xié)助機(jī)體抵抗病毒侵染。

2 熱應(yīng)激蛋白HSP40 家族抗病毒免疫效應(yīng)

HSP40 家族在蛋白質(zhì)的初級水平上非常多樣化但總體上具體分為4 個結(jié)構(gòu)域，高度保守的N 端J 結(jié)構(gòu)域，富含甘氨酸和苯丙氨酸的G/F 結(jié)構(gòu)域，富含半胱氨酸的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域和保守程度較低的C 末端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域[28]?；谶@些區(qū)域的差異HSP40 家族可以被分為三類，Ⅰ型含有4 個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)如與HSP40 同源的大腸桿菌共伴侶DnaJ，Ⅱ型缺乏鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)如人類HDJ-1 蛋白和Ⅲ型僅保留J 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)如酵母sec63 蛋白[29]。除了上述結(jié)構(gòu)域外，有些HSP40 家族成員還存在其他的結(jié)構(gòu)域這形成了其功能的多樣性。

HSP40 是熱應(yīng)激蛋白家族中跨物種存在的高度保守的蛋白家族，存在于細(xì)菌和人類的各種組織中[30]。HSP40 作為分子伴侶的主要功能是與蛋白底物特異性結(jié)合，HSP40 與未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合并將其遞送至與ATP 結(jié)合的HSP70，ATP 在HSP40 的刺激下水解，HSP70 的底物親和力增加與目標(biāo)蛋白牢牢結(jié)合，核苷酸交換因子促進(jìn)HSP70 蛋白返回ATP 結(jié)合狀態(tài)，這導(dǎo)致折疊蛋白的釋放，重復(fù)該循環(huán)直至目標(biāo)蛋白質(zhì)正確折疊[31]。現(xiàn)如今對HSP40 的主要認(rèn)識是HSP70 蛋白的輔助因子，參與轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞成長和增殖等生理生化過程。越來越多的研究人員發(fā)現(xiàn)，HSP40 家族可直接作為伴侶蛋白參與病毒的復(fù)制繁殖等過程。有研究表明人類免疫缺陷病毒早期蛋白（Nef）可以與宿主編碼的HSP40 蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)其在被人類免疫缺陷病毒Ⅰ型病毒（HIV-Ⅰ）感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)HSP40 蛋白表達(dá)量增多時缺失Nef蛋白的病毒生長速度開始下降[32]。乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）是一種多功能毒力因子，在病毒復(fù)制和肝細(xì)胞癌發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。Sohn 等在人肝癌細(xì)胞HepG2 中實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP40 伴侶蛋白主要是通過蛋白酶體途徑促進(jìn)HBX 的降解從而抑制野生型HBV 的復(fù)制，HBX 蛋白是HSP40 抑制HBV 復(fù)制的主要靶點(diǎn)[33]。Sohn 等在原實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡述了HSP40 蛋白抗病毒作用的分子機(jī)制，HSP40 伴侶家族蛋白成員Hdj1和hTid1的異位表達(dá)抑制了人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中HBV 的復(fù)制，通過RNA 干擾敲低hTid1 的表達(dá)量則導(dǎo)致HBV 的復(fù)制量增加，該研究同時證明HSP40 對病毒復(fù)制和病毒衣殼形成均具有抑制作用，并且能靶向增加目標(biāo)蛋白的降解[34]。

3 熱應(yīng)激蛋白HSP60 家族抗病毒免疫效應(yīng)

HSP60 是熱應(yīng)激蛋白家族中最為重要的成員之一，其同源性較高，廣泛存在于原核及真核生物內(nèi)，并且作為分子伴侶在天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮著重要作用。HSP60 可以直接激活天然免疫也可以通過與病原體相關(guān)分子模式結(jié)合激活獲得性免疫。HSP60 同時也具有免疫調(diào)節(jié)特性，其作為趨化因子在細(xì)胞損傷處招募血液中的嗜中性粒細(xì)胞，刺激嗜中性粒細(xì)胞分泌抗菌酶類或直接增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性[35]。近年來的研究表明，當(dāng)病毒侵染機(jī)體時，HSP60 可與抗原短肽形成復(fù)合物或融合蛋白在呈遞抗原時經(jīng)MHC-I類途徑加工，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性CD8+激活抗原特異性CTL 的第二信號[36]，它能夠優(yōu)先和變性蛋白結(jié)合從而保護(hù)細(xì)胞免受病毒脅迫。Yang 等將H1N1 病毒的MI基質(zhì)蛋白和核蛋白與HSP60融合并在大腸桿菌中表達(dá)重組，純化后通過鼻內(nèi)免疫小鼠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白NP-M1-HSP60 顯著抑制了小鼠肺中的病毒復(fù)制量并且保護(hù)小鼠在感染H7N9病毒時未致死[37]。Shan等的研究證明HSP60的過表達(dá)增加了抗凋亡Bcl-xl 和Bcl-2 的豐度，降低了促凋亡Bax 的蛋白含量，從而減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌死亡[38]。Murata 等研究發(fā)現(xiàn)線粒體遷移到單純皰疹病毒（HSV）感染的細(xì)胞質(zhì)中的核周區(qū)域同時促進(jìn)了HSP60的表達(dá)，并在感染的中期保持抗病毒功能[39]。因此，HSP60 有望成為DNA 疫苗研制的重要候選之一。

4 熱應(yīng)激蛋白HSP90 家族參與病毒免疫效應(yīng)

HSP90 是熱應(yīng)激家族中最活躍的分子伴侶之一也是家族中為數(shù)不多的含有內(nèi)含子的成員，具有重要的生物學(xué)功能（表1）。HSP90 通常以二聚體的形式存在，并需要結(jié)合ATP 以發(fā)揮作用，HSP90 可以與基因啟動子相應(yīng)元件結(jié)合形成復(fù)合體進(jìn)而與協(xié)同伴侶，類固醇受體，蛋白激酶等功能蛋白特異性結(jié)合從而改變蛋白的功能狀態(tài)[40]。近年來的研究證明，HSP90 是病毒復(fù)制的一種重要宿主，能夠影響病毒聚合酶的活性進(jìn)而干擾病毒的復(fù)制，還有研究表明HSP90 通過對底物蛋白質(zhì)的作用而影響病毒的侵染和發(fā)展[41]。Ian 等的研究表明HSP90 通過保持核因子κB 激酶（IKK）復(fù)合物功能來控制艾滋病病毒Ⅰ型（HIV-1）潛伏期的激活，從而將T 細(xì)胞活化后與HIV-1 復(fù)制連接起來[42]。Dipanjan 等的研究表明HSP90 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號蛋白來調(diào)節(jié)輪狀病毒并且強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞蛋白在輪狀病毒感染中的重要性，以及靶向細(xì)胞伴侶蛋白用以開發(fā)新的抗輪狀病毒的可能性[43]。此外，HSP90 也可與病毒基因組互作，促進(jìn)病毒復(fù)制。Gorovits 等以番茄為模型將HSP90 沉默，并將番茄黃化曲葉病毒侵染番茄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默處理組的番茄葉片不顯癥狀，表明HSP90 有助于病毒復(fù)制[44]。Chase 等通過17-烯丙基氨基-去甲氧基格爾德霉素（17-AAG）和格爾德霉素（GA）抑制HSP90而促進(jìn)了病毒蛋白的降解，GA 的增加導(dǎo)致3 種病毒RNA 的劑量依賴性降低，具體表現(xiàn)為mRNA、cRNA和vRNA，說明病毒RNA 的積累依賴于HSP90 蛋白含量[45]。Dipanjan 等通過下調(diào)HSP90 基因的表達(dá)成功的抑制了丙型肝炎病毒（HCV）在體內(nèi)的復(fù)制，靶向病毒基因組的小干擾RNA（siRNA）與HSP90 mRNA 的結(jié)合也成功地減少了HCV 的復(fù)制，降低了病毒耐藥性的發(fā)生[46]。王少華利用HSP90 的特異性抑制劑17-AAG能顯著抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的增殖和表達(dá)，同時結(jié)果顯示在病毒感染的早期抑制效果最明顯[47]。當(dāng)機(jī)體遇到病毒或細(xì)菌侵染時，體內(nèi)HSP90 的表達(dá)水平顯著區(qū)別于正常生理狀態(tài)，但HSP90 的表達(dá)量是否可以用于評價機(jī)體的環(huán)境適應(yīng)能力和應(yīng)激能力仍然有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表1 熱應(yīng)激蛋白與病毒互作Table 1 Interaction between heat stress proteins and viruses

續(xù)表

5 小結(jié)與展望

熱應(yīng)激蛋白廣泛存在于動物機(jī)體的各個器官，在機(jī)體抗應(yīng)激損傷過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。作為一類高度保守蛋白，它參與了許多生理功能，除參與細(xì)胞周期控制、細(xì)胞增殖發(fā)育與凋亡，細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)，增加細(xì)胞耐受性等生理過程之外，在免疫反應(yīng)的抗原呈遞和活化方面也發(fā)揮了重要作用。隨著研究水平的逐漸深入，熱應(yīng)激蛋白與病毒的相互作用將會被越來越多的人認(rèn)可，未來的研究很可能會在這一領(lǐng)域揭示更多的示例，以此加深我們對這些共同伴侶在病毒中的理解。當(dāng)前，依據(jù)熱應(yīng)激蛋白特殊的生物學(xué)特性也完全可以為DNA 疫苗或某些廣譜抗病毒藥物的研制提供一定的方向和思路，并廣泛用于治療多種病毒性感染的疾病。而不同的熱應(yīng)激蛋白與不同的功能蛋白結(jié)合時，則會產(chǎn)生不同的作用效果和作用機(jī)制，因此我們還需在研制過程中準(zhǔn)確評估和分析，相信這些相互作用同樣可以為新的抗病毒策略提供目標(biāo)。