衍生化HPLC法測(cè)定藥物有效成分的研究分析

姚元元

摘要：高效液相色譜（HPLC）法在樣本物質(zhì)含量的檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，但是這一技術(shù)無(wú)法檢測(cè)對(duì)熒光和紫外沒(méi)有信號(hào)的物質(zhì)。衍生化將樣本中的待分析物轉(zhuǎn)化成合適的物質(zhì)形式以方便HPLC檢測(cè)，成為HPLC檢測(cè)的重要彌補(bǔ)手段。本文對(duì)當(dāng)前衍生化HPLC法測(cè)定藥物有效成分的應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;藥物;有效成分

藥物中的有效成分含量多少以及有效成分種類(lèi)在評(píng)估藥物質(zhì)量與真?zhèn)沃蟹浅Ｖ匾?，鑒定、檢測(cè)藥物中的有效成分在藥品質(zhì)量控制中應(yīng)用廣泛。高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）法是藥品有效成分分離與分析的常用方法，但是儀器的熒光、紫外檢測(cè)器對(duì)藥物中的醇類(lèi)、氨基酸類(lèi)、羧酸類(lèi)以及脂肪酸類(lèi)有效成分檢測(cè)效果并不理想。衍生化技術(shù)將藥品中的成分衍生化為合適的成分來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，這使得HPLC的檢測(cè)范圍得到了擴(kuò)大，也提高了檢測(cè)靈敏度。

1、衍生化HPLC

衍生化（derivatization）技術(shù)采用試劑將樣本中的待分析物轉(zhuǎn)化為更適合的物質(zhì)形式，從而為檢測(cè)提供方法。衍生化技術(shù)能夠消除基質(zhì)的干擾，增強(qiáng)離子化效率或者改變分析物的理化性質(zhì)，能夠提高物質(zhì)的分離程度，使得目標(biāo)選擇性與檢測(cè)儀器的靈敏度得到提高[1]。衍生化HPLC在生物、環(huán)境、食品以及醫(yī)藥等各個(gè)領(lǐng)域的痕量分析物檢測(cè)中均應(yīng)用廣泛。

從衍生有沒(méi)有與HPLC聯(lián)機(jī)的角度劃分，可以將化學(xué)衍生法分為離線與在線兩種;根據(jù)衍生化反應(yīng)的發(fā)生部位來(lái)劃分，可以將其劃分為柱前、柱中以及柱后衍生化法。在線柱中衍生化法在手性藥物分離對(duì)映體中應(yīng)用廣泛，其根據(jù)藥物與衍生化試劑對(duì)映體的反應(yīng)來(lái)形成非對(duì)映體的產(chǎn)物;衍生化法改變藥物成分的官能團(tuán)，從而使其具有理想的熒光檢測(cè)信號(hào)與紫外檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度與檢測(cè)范圍。上述兩種原理不同，因此文章中僅對(duì)當(dāng)前應(yīng)用廣泛的在線柱后衍生化法與柱前衍生化進(jìn)行討論。

2、常用衍生化HPLC法的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 柱前衍生化法

柱前衍生化反應(yīng)容易操作，可以采用手工離線的方法實(shí)現(xiàn)樣品的純化與反應(yīng)，對(duì)容積、混合試劑的要求不高，對(duì)試劑用量、反應(yīng)條件以及反應(yīng)時(shí)間等都要求不高。該方法能提高檢測(cè)的靈敏度，還有助于提高色譜分辨率與分離方法的選擇性。

對(duì)氨基酸類(lèi)藥物進(jìn)行測(cè)定時(shí)，2，4-二硝基氟苯是最常用的試劑。醇類(lèi)是表面活性劑的關(guān)鍵原料之一，特別是脂肪醇乙氧基化合物在化妝品行業(yè)與藥物中都應(yīng)用廣泛，其對(duì)環(huán)境具有一定污染性。對(duì)醇類(lèi)化合物的測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化，其應(yīng)用價(jià)值較高。陳哲等[2]建立柱前衍生反相HPLC對(duì)琺菲亞中的14種氨基酸進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，衍生化試劑為異硫氰酸苯酯，建立了14種氨基酸同時(shí)測(cè)定的方法。李滋等[3]采用苯甲醛作為衍生化試劑，對(duì)異煙肼注射液中游離脛的含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)游離脛檢出限為0.5g/ml，為異煙肼注射液質(zhì)控提供了檢測(cè)方法。

2.2 柱后衍生化法

這一反應(yīng)在檢測(cè)器與色譜柱之間的反應(yīng)器完成，其屬于在線衍生化方法。就反應(yīng)器方面，由不銹鋼、聚四氟乙烯、玻璃等制成的管狀反應(yīng)器是最為簡(jiǎn)單的反應(yīng)器，可以應(yīng)用于滯留時(shí)間不超過(guò)30s的快速反應(yīng)。例如將鄰苯二甲醛（OPA）作為柱后衍生試劑，與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，能夠盡可能避免柱前手動(dòng)衍生物可能存在的不穩(wěn)定因素，該方法的靈敏度與分辨率均較高。柱床反應(yīng)器適用于1-5min滯留時(shí)間的中等速度的反應(yīng)，其在反應(yīng)器內(nèi)填充固定化酶制成穩(wěn)定的柱床，通入底物溶液，流動(dòng)相經(jīng)過(guò)玻珠時(shí)與玻珠上的衍生化反應(yīng)物發(fā)生反應(yīng)，根據(jù)一定流速來(lái)收集轉(zhuǎn)化液。載流式反應(yīng)器適用于滯留時(shí)間在5min以上的反應(yīng)，其盤(pán)管細(xì)長(zhǎng)，出于減少峰擴(kuò)張的目的，試劑與洗脫液混合的過(guò)程中要將空氣不斷打入，或者打入不溶于流動(dòng)相的容積，從而促使溶液在分割的情況下流動(dòng)，這一方法可維持峰擴(kuò)張不超過(guò)10%。除此之外，光化學(xué)檢測(cè)反應(yīng)器適用于一些僅需光照即可完成結(jié)構(gòu)變化的反應(yīng)物。

就柱后衍生化的試劑選擇方面，OPA是氨基酸、胺的柱后衍生化試劑，其與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成熒光衍生物，其具有快速、靈敏的特點(diǎn)，檢測(cè)效果良好，是柱后衍生化的常用試劑。張楊慧等[4]應(yīng)用OPA進(jìn)行柱后衍生化，建立了硫酸卡那霉素注射液及滴眼液含量的檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)卡那霉素在0.0973-583.8g/ml濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好（r=0.9999）。蘇小潔[5]采用濃度0.05%的碘溶液作為衍生試劑，采用免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法檢測(cè)山楂黃曲霉素B1、B2、G1、G2含量，發(fā)現(xiàn)其最低檢出限分別為0.6pg、0.1pg、0.7pg、0.2pg。

3、結(jié)論

衍生法HPLC以柱前衍生化法與柱后衍生化法比較常用。前者優(yōu)點(diǎn)眾多，但是部分衍生化后的部分化合物反應(yīng)產(chǎn)物種類(lèi)較多，這使得樣品組分有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)多個(gè)色譜峰而使得色譜圖變得非常復(fù)雜，因此柱前衍生化法的應(yīng)用有一定限制。柱后衍生化法在經(jīng)過(guò)色譜柱分離后、進(jìn)入檢測(cè)器前進(jìn)行，因此這一方法可以連續(xù)、自動(dòng)地進(jìn)行，具有容易操作的優(yōu)勢(shì)。由于該方法在分離后完成衍生化，這使得色譜分離能將樣品自身的性質(zhì)反應(yīng)出來(lái)。柱后衍生化法也存在一定限制，例如要求衍生化反應(yīng)具有良好重現(xiàn)性，要求控制反應(yīng)時(shí)間，還要求過(guò)量衍生試劑與反應(yīng)后生成的副產(chǎn)物不能對(duì)檢測(cè)造成影響，受到這些限制，柱后衍生化法的應(yīng)用還并不廣泛。但是總的來(lái)說(shuō)，衍生化法HPLC的發(fā)展前景廣闊。

參考文獻(xiàn)

[1]何繼杰，張曉鳳，錢(qián)莉莉，等.痕量氨基酸分析方法研究進(jìn)展[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2019，35（04）：507-513.

[2]陳哲，路娟，彭紀(jì)銘，等.柱前衍生RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定琺菲亞中14種水解氨基酸[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2017，35（02）：130-133.

[3]李滋，于潤(rùn)芳，侯寧，等.柱前衍生化HPLC法測(cè)定異煙肼注射液中游離肼的含量[J].藥物分析雜志，2017，37（02）：316-319.

[4]張楊慧，蔣孟虹，秦峰，等.柱后衍生化-HPLC法測(cè)定硫酸卡那霉素注射液及滴眼液的含量[J].中國(guó)抗生素雜志，2019，44（01）：88-93.

[5]蘇小潔，潘顯茂.用免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法檢測(cè)山楂干中多種黃曲霉毒素含量的效果觀察[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2018，16（16）：189-190.