烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物有效成分的提取

孟婷婷　彭艷玲　王鈺璽等

摘要：甘草為豆科多年生草本植物，化學(xué)成分復(fù)雜，具有多種生物學(xué)活性與藥理學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于臨床、食品、保健品、化妝品等行業(yè)。以懸浮培養(yǎng)的烏拉爾甘草細(xì)胞為研究對象，采用雙因素?zé)o重復(fù)試驗法對懸浮細(xì)胞的有效成分提取方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：選取70%乙醇作為提取劑，在料液比 1 g ∶10 mL的提取條件下，烏拉爾甘草中的2大類有效成分——三萜皂苷類化合物、黃酮類化合物都得到充分析出；在此提取條件下，懸浮細(xì)胞中黃酮類化合物的含量為0.020 0 g/g，大約是野生烏拉爾甘草根粉中黃酮類化合物含量的23%。

關(guān)鍵詞：烏拉爾甘草；懸浮細(xì)胞；有效成分；提?。稽S酮類化合物

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0063-03

收稿日期：2014-10-21

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31460064）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（編號：2013MS051）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（編號：NJZY13152）。

作者簡介：孟婷婷（1991—），女，河南開封人，碩士研究生，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究。E-mail：wymtt1991@163.com。

通信作者：李雅麗，博士，教授，主要從事植物次生代謝調(diào)控研究。E-mail：btliyali@126.com。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）被稱為“眾藥之王”，有廣泛的藥理學(xué)活性，是多種中成藥與配方制劑的主要成分，同時也因為其特有的甜味而作為食品添加劑（低熱值甜味劑）廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)，國內(nèi)外市場需求量很大[1-4]。近些年來，由于無序采挖、生態(tài)環(huán)境惡化，造成甘草主產(chǎn)區(qū)野生資源瀕臨枯竭[5]，表現(xiàn)在栽培品種收獲期過長、病蟲害嚴(yán)重、質(zhì)量低下，導(dǎo)致甘草資源面臨危機(jī)。植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)因具備不占用土地、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)條件和環(huán)境人工可控等優(yōu)勢，成為現(xiàn)有的植物資源替代生產(chǎn)天然藥物途徑中最有潛力的方法之一[6-7]。在對甘草細(xì)胞進(jìn)行離體懸浮培養(yǎng)的過程中，細(xì)胞內(nèi)有效成分的提取是一個主要的研究內(nèi)容，充分高效地分離出細(xì)胞培養(yǎng)物中的有效成分是下一步應(yīng)用的保證[8]。本研究以產(chǎn)自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達(dá)拉特旗的烏拉爾甘草種子獲得的離體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，通過雙因素?zé)o重復(fù)試驗篩選懸浮細(xì)胞有效成分的提取工藝，以期促進(jìn)甘草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，加快工業(yè)化生產(chǎn)天然藥物的進(jìn)程。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗材料為烏拉爾甘草種子，購自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達(dá)拉特旗。主要試劑為蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國藥品生物制品檢定所，純度92.5%；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

BRANSON超聲波清洗器，必能信超聲（上海）有限公司；722可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；YP502N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SynergyTM HT多功能酶標(biāo)儀，BioTek。

1.3試驗設(shè)計

對烏拉爾甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞有效成分的提取采用全面試驗設(shè)計法進(jìn)行優(yōu)化，全面試驗設(shè)計法是對所選取的試驗因素的所有水平組合全部實施1次以上試驗，此方法適用于單因素和雙因素試驗，可獲得全面試驗信息，準(zhǔn)確地估計各試驗因素主效應(yīng)的大小及各因素之間各級交互作用效應(yīng)的大小[9]。從有效成分提取的影響因素中抽取2個主要因素設(shè)置均勻水平，本試驗分別以甲醇、乙醇作為提取劑，采用超聲提取法，選擇提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、料液比（g ∶mL，1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50） 2個主要影響因素，分別設(shè)計10個水平，進(jìn)行雙因素?zé)o重復(fù)試驗。

1.4烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞供試樣品的制備

將生長1個周期（21 d）的烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞用布氏漏斗抽濾后，用無菌水沖洗，去除表面殘留的培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫烘箱中烘干至恒質(zhì)量，研磨成粉末后過100目篩得烏拉爾甘草細(xì)胞粉末。準(zhǔn)確稱取180份0.5 g的甘草粉末于180個100 mL的三角瓶中，依據(jù)所設(shè)計的雙因素?zé)o重復(fù)試驗，按不同料液比（影響因素A）加入不同濃度提取劑（影響因素B），放置24 h過夜后，置于超聲清洗器中超聲提取30 min，超聲后的料液立即置于漏斗過濾得濾液，靜置，取上清樣于4 ℃冰箱中保存[10]。

1.5酶標(biāo)儀法檢測

采用酶標(biāo)儀檢測供試樣品。分別吸取5 μL樣品溶液，點入96孔點樣板中，加入245 μL超純水混勻，依次放入酶標(biāo)儀檢測槽中。分別在254、377、410 nm波長下檢測樣品的吸光度D254 nm、D377nm、D410 nm，以不加樣品組為對照。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)物中黃酮類化合物測定

1.6.1蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品并用甲醇溶解，配成0.1 mg/mL的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于7支試管中，添加5 mL甲醇、0.5 mL 10% KOH溶液，充分搖勻顯色5 min后，用甲醇定容至10 mL，搖勻，用分光光度計檢測410 nm處的吸收度D410 nm。

1.6.2黃酮類化合物測定各取出0.2 mL制備好的5批烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞供試樣品溶液，分別置于5支10 mL試管中，各加5 mL甲醇、0.5mL 10% KOH顯色劑，顯色5 min后，定容到10 mL，用分光光度計檢測其在410 nm處的吸光度D410 nm。同時制備1份野生甘草根粉樣品作為對照[11]。

2結(jié)果與分析

2.1不同提取劑條件所得提取液的D254 nm

254 nm是甘草中主要成分——以甘草酸為代表的三萜皂苷類化合物的主要檢測波長。如圖1所示，采用60%甲醇、90%甲醇作為提取劑，料液比為1 g ∶10 mL時，在254 nm處有較大吸光度；以70%～90%乙醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL時，在254 nm處有較大吸光度。

2.2不同提取劑條件所得提取液的D377nm、D410 nm

377、410 nm是甘草中另外一大類主要成分——以甘草苷為代表的黃酮類化合物的主要檢測波長，如圖2所示：以80%甲醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL時，在377 nm處有最大吸光度；以70%乙醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL時，在377 nm處有最大吸光度。如圖3所示，以80%、90%甲醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL時，在410 nm處有較大吸光度；以70%乙醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL時，在410 nm處有最大吸光度。

綜合以上3個波長下所測的樣品光吸光度，確定選取70%乙醇作為提取劑，在料液比1 g ∶10 mL條件下，提取液在254、377、410 nm處均有較大吸光度，表明甘草懸浮細(xì)胞中的主要有效成分無論是三萜皂苷類化合物還是黃酮類化合物都能被充分地析出。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)物中黃酮類化合物的測定

2.3.1蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以蕓香苷溶液濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，用Origin 8.0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到標(biāo)準(zhǔn)方程D=4.125 7C+0.082 98，r2=0.998（D為吸光度，C為蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度），詳見圖4，表明蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度與D410 nm呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞中黃酮類化合物的含量5份烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞供試樣品溶液經(jīng)分光光度計檢測后結(jié)果如表1所示，根據(jù)懸浮培養(yǎng)的“2.3.1”節(jié)所得標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程計算，烏拉爾甘草細(xì)胞中黃酮類化合物的含量是 0.020 0 g/g，同法測得野生烏拉爾甘草根粉中黃酮類化合物的含量是0.088 0 g/g，懸浮烏拉爾甘草細(xì)胞中黃酮類化合物含量大約是野生烏拉爾甘草根粉中黃酮類化合物含量的23%。

3結(jié)論

以產(chǎn)自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達(dá)拉特旗的烏拉爾甘草種子通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的離體懸浮細(xì)胞為研究對象，通過雙因素?zé)o重復(fù)試驗篩選了烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物有效成分提取的最佳工藝。甘草具有多種生物學(xué)活性與藥理學(xué)活性，而起主要作用的有效成分通常被認(rèn)為是三萜皂苷類和黃酮類化合物。試驗結(jié)果表明，以70%乙醇為提取劑、料液比1 g ∶10 mL 的條件下超聲提取，甘草中的主要有效成分得到充分析出。

分析了懸浮烏拉爾甘草離體細(xì)胞中黃酮類化合物的含量，結(jié)果表明：懸浮培養(yǎng)的烏拉爾甘草細(xì)胞中的黃酮類化合物含量是野生烏拉爾甘草中黃酮類化合物含量的23%。雖然懸浮培養(yǎng)的烏拉爾甘草細(xì)胞中黃酮類化合物總含量遠(yuǎn)低于野生烏拉爾甘草，但懸浮培養(yǎng)周期短，僅需3周，而野生甘草生長周期長達(dá)4～5年；此外，懸浮培養(yǎng)方便、快捷、易人工控制，避免了病蟲害等其他自然因素的影響。因此，利用甘草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物為緩解甘草野生資源危機(jī)提供了可行的途徑[12]。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhang Q Y，Ye M. Chemical analysis of the Chinese herbal medicine Gan-Cao （licorice）[J]. Journal of chromatography A，2008，1216（11）：1954-1969.

[2]惠壽年，董阿玲. 國內(nèi)對甘草化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J]. 中草藥，1999，30（4）：313-315.

[3]賈國惠，賈世山. 甘草中黃酮的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志，1998（9）：3-6.

[4]Haraguchi H，Tanimoto K，Tamura Y，et al. Mode of antibacterial action of retrochalcones from Glycyrrhiza inflata[J]. Phytochemistry，1998，48（1）：125-129.

[5]董靜洲，易自力，蔣建雄. 我國藥用植物資源研究概況[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志，2006，35（1）：67-69.

[6]Vanisree M，Lee C Y，Lo S F，et al. Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures[J]. Botanical Bulletin of Academia Sinica，2004，45（1）：1-22.

[7]Cai Z，Kastell A，Knorr D，et al. Exudation：an expanding technique for continuous production and release of secondary metabolites from plant cell suspension and hairy root cultures[J]. Plant Cell Reports，2012，31（3）：461-477.

[8]鄭成，李衛(wèi)，楊鈴. 植物有效成分微波萃取的研究進(jìn)展[J]. 世界科技研究與發(fā)展，2006，28（5）：52-61.

[9]程艷芹，孫秀梅，張兆旺，等. 均勻設(shè)計法優(yōu)選甘草的半仿生提取工藝條件[J]. 中藥材，2007，30（5）：598-601.

[10]鄧引梅，宋發(fā)軍，崔永明，等. 甘草葉總黃酮提取工藝[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，27（1）：41-43.

[11]王磊，楊英，周圓圓，等. 甘草細(xì)胞培養(yǎng)物黃酮含量測定方法的建立[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2007，18（12）：3046-3047.

[12]Sheludko Y V. Recent advances in plant biotechnology and genetic engineering for production of secondary metabolites[J]. Cytology and Genetics，2010，44（1）：52-60.李慧. 紅顏草莓的離體培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：66-68.