食品微生物檢驗(yàn)檢測方法研究進(jìn)展

摘 要：隨著科技的迅速發(fā)展，尤其是生物學(xué)技術(shù)方面，我國的食品檢驗(yàn)技術(shù)也逐步從傳統(tǒng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)入分子等先進(jìn)技術(shù)方向。本文就近些年新的技術(shù)方法的概念、原理、特點(diǎn)進(jìn)行闡述，為建立食品微生物更高效的檢驗(yàn)檢測系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：食品微生物；檢驗(yàn)檢測；分子生物學(xué)技術(shù)

如今，信息科技的發(fā)展，不僅便利了生活，也讓人們面對的問題越來越多，比如三聚氰胺奶粉案。食品的安全問題已成為現(xiàn)在人們關(guān)注的焦點(diǎn)，做好食品安全檢測尤為重要。而在食品檢驗(yàn)檢測中，通常微生物的檢驗(yàn)過程是尤為繁雜的。由于微生物的種類繁多，每一種微生物的生存環(huán)境不一樣，這給檢驗(yàn)工作帶來很大壓力。目前，已有很多省時省力的檢測方法出現(xiàn)，下面就對現(xiàn)在微生物檢測的前沿技術(shù)進(jìn)行闡述。

1 分子生物學(xué)技術(shù)

1.1 PCR技術(shù)

PCR是一種擴(kuò)增DNA片段的分子技術(shù)，由于菌體中的一些基因保守性很強(qiáng)，因此可擴(kuò)增其相應(yīng)的保守序列，來準(zhǔn)確、快速地檢測菌體。具有操作便捷、檢測快捷、準(zhǔn)確率高、靈敏度高與目標(biāo)特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，在微生物檢驗(yàn)檢測過程中得以廣泛應(yīng)用。目前該方法已被應(yīng)用在乳制品中雙歧桿菌、乳酸菌及酵母菌的檢測中，且能對沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀桿菌、單核細(xì)胞李斯特菌與金黃色葡萄球菌等致病菌進(jìn)行有效測定[1]。

PCR技術(shù)還可與新技術(shù)結(jié)合，形成新的PCR衍生技術(shù)。例如，qRTPCR、Multiplex PCR以及PCR-DGGE和LAMP等。其中，qRT-PCR，即實(shí)時熒光PCR技術(shù)，相對于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)而言，具有更強(qiáng)的特異性、更高的自動化程度，且不易污染，近年來已在多種致病細(xì)菌、霉菌、酵母菌母以及乳酸菌等重要食品微生物指標(biāo)的定性和定量檢測中廣泛應(yīng)用。PCRDGGE，則是PCR與變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)相結(jié)合，形成的一項(xiàng)新技術(shù)方法。該方法是通過選擇電泳條件，根據(jù)DNA片段中的堿基差異區(qū)分微生物。該技術(shù)可用于不可培養(yǎng)型細(xì)菌的檢測，具有高檢測率以及高重復(fù)性特點(diǎn)，目前該項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在發(fā)酵類食品以及酒類等的檢驗(yàn)和研究中。Multiplex PCR多被應(yīng)用在食品病原微生物檢測中，其中可檢測出肉類中沙門菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌O157∶H7[2]。LAMP利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動互補(bǔ)鏈的合成，結(jié)果在同一鏈會形成有很多環(huán)的結(jié)構(gòu)的莖—環(huán)DNA混合物，反應(yīng)結(jié)果可直接靠擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度進(jìn)行判斷。在大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌與金黃色葡萄球菌中已有廣泛應(yīng)用[3]。

1.2 基因芯片

基因芯片技術(shù)是將帶有寡核苷酸的芯片與樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備的熒光標(biāo)記探針雜交，通過掃描儀分析熒光分布模式來確定樣品中是否存在特異微生物，具有檢驗(yàn)范圍廣、操作快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，有廣泛的應(yīng)用前景。例如，何洋[4]建立了一種利用基因芯片快速檢測鑒定食品中金黃色葡萄球菌的技術(shù)，過程僅需7 h，且實(shí)用性、特異性和穩(wěn)定性很強(qiáng)。

1.3 核酸探針

核酸探針是指帶有標(biāo)記的特異DNA片段，通過堿基互補(bǔ)與目的DNA雜交，再用特定的方法測定標(biāo)記物，來判斷特異性微生物是否存在。該方法包含放射性標(biāo)記、非放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記核酸探針的特異性非常強(qiáng)；而非放射性標(biāo)記的類型多，有熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、免疫標(biāo)記與地高辛標(biāo)記等，具有直觀、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。核酸探針技術(shù)主要用于食品中致病性病原菌的檢測。例如，生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)標(biāo)記的探針[5]已在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒檢測中應(yīng)用。

2 免疫學(xué)技術(shù)

2.1 免疫熒光

免疫熒光技術(shù)是在特異性抗體（或抗原）上標(biāo)記熒光色素，然后與待檢樣品中微生物的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合，通過熒光顯微鏡檢測特異性熒光反應(yīng)，以達(dá)到檢測相應(yīng)微生物的目的。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。目前，可用來對沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E-Coli O157和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等進(jìn)行快速檢測[6]。

2.2 酶聯(lián)免疫

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)是通過固相載體將抗原或抗體吸附于表面，而后進(jìn)行免疫酶染色，再進(jìn)行底物顯色，通過定性或定量分析有色產(chǎn)物即可確定樣品中是否存在特異微生物。該方法具有反應(yīng)靈敏、標(biāo)記物穩(wěn)定、適用范圍廣、結(jié)果判斷準(zhǔn)確以及費(fèi)用低等特點(diǎn)。例如，王靜[7]等利用其檢測腸出血性大腸桿菌，可在40 min內(nèi)完成。

酶聯(lián)免疫結(jié)合免疫熒光技術(shù)形成一種新的檢測技術(shù)叫酶聯(lián)熒光免疫檢測，該方法大大提高了檢測效率。例如，陳思強(qiáng)[8]等采用自動酶聯(lián)熒光免疫分析系統(tǒng)對凍肉中沙門氏菌進(jìn)行檢測，大大提高了檢驗(yàn)效率。

2.3 免疫層析

免疫層析是將待測物與條狀纖維膜上一定區(qū)域的配體結(jié)合，通過毛細(xì)管使樣品在條狀纖維膜上泳動，而后進(jìn)行酶促顯色反應(yīng)或直接使用著色標(biāo)記物，以達(dá)到檢測特異微生物的目的。按原理可分為兩類，一類以酶促反應(yīng)顯色為基礎(chǔ)，以顯色度來定量；另一類則使用著色標(biāo)記物如乳膠顆粒、膠體硒、膠體金以及脂質(zhì)體等進(jìn)行檢測。例如，杜邦的大腸桿菌O157： H7、沙門氏菌、李斯特菌等檢測試紙條，檢測金黃色葡萄球菌的Aureus Test試劑盒都是基于免疫層析技術(shù)的產(chǎn)品。

2.4 免疫磁珠

免疫磁珠法是在磁性顆粒表面偶聯(lián)特異性抗體，并與樣品中被檢微生物中的特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，通過磁場作用于載有微生物的磁性顆粒，使微生物可得到特異性分離、濃集。該方法使食品檢測更加快速、高效，且具有可重復(fù)性。據(jù)報道，可以通過該種技術(shù)來完成對大腸桿菌0111、0145、0157以及沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的檢測和鑒定。

2.5 免疫擴(kuò)散

免疫擴(kuò)散是指特異性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中擴(kuò)散、結(jié)合，在適當(dāng)比例處形成沉淀線，根據(jù)沉淀線生物有無、形狀、位置等進(jìn)行抗原（抗體）定性及定量分析。其介質(zhì)多種多樣，例如瓊脂、明膠、果膠與聚丙烯酰胺等，適用范圍廣，目前廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測中。

2.6 免疫印跡

免疫印跡是根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白（特有的），能夠?qū)μ禺愋钥乖贵w）進(jìn)行定性、定量分析。該技術(shù)融合了SDSPAGE的高分辨率及酶聯(lián)免疫技術(shù)的高敏感性和高特異性，是一種準(zhǔn)確、高效的分析手段，已被廣泛應(yīng)用于檢測酵母、真菌及疾病的診斷中。

3 生理生化技術(shù)

3.1 傳統(tǒng)代謝組學(xué)技術(shù)

3.1.1 電阻抗法

由于微生物在生長過程中可代謝導(dǎo)電性弱的大分子底物，使之變成導(dǎo)電性強(qiáng)的小分子底物，使培養(yǎng)基的電導(dǎo)性增強(qiáng)，培養(yǎng)物的阻抗降低，形成特征性阻抗曲線，電阻抗法即利用這一特性達(dá)到鑒定微生物的目的。該方法具有特異性、快速反應(yīng)性、高敏感性和高重復(fù)性等特點(diǎn)。目前，該法已被廣泛應(yīng)用于食品中細(xì)菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母菌和商業(yè)無菌的檢測[9]。

3.1.2 微熱量計法

微生物在生長過程中會產(chǎn)生熱量，利用微熱量計測量特征性微生物的產(chǎn)熱量等特異性數(shù)據(jù)，繪制成時間與產(chǎn)熱量對比組成的熱曲線圖，將所有特征性微生物的熱曲圖綜合后形成圖庫。待測微生物的熱曲線圖與已知細(xì)菌熱曲線圖直觀比較，即可對微生物進(jìn)行鑒別。該方法操作便捷、檢測效率高、應(yīng)用范圍廣。例如，美國TA公司的TAM Ⅲ系統(tǒng)就是基于該原理對菌體進(jìn)行鑒別的。

3.1.3 微量生化法

微量生化法是通過對菌體生長過程中生化特性變化的檢測，以鑒定菌體。該方法具有簡單、快速、可靠等特點(diǎn)。目前已有多種高精密度和高重現(xiàn)性的微生物鑒定用試劑盒，例如，MICRO-ID可用于檢測李斯特氏菌；API用其獨(dú)特的數(shù)值鑒定法可鑒定15個系列、600多種細(xì)菌。

3.1.4 放射測量技術(shù)

放射測量技術(shù)是將培養(yǎng)基中的碳水化合物或鹽類等底物分子，引入放射性14C標(biāo)記，通過微生物代謝碳水化合物或底物后，釋放出含放射性的14CO2，再用自動化放射測定儀測量14CO2的含量，以達(dá)到檢測微生物的目的。該方法具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。在測定食品中的細(xì)菌得以廣泛應(yīng)用，如常用的Bactec MGIT 960系統(tǒng)[10]。

3.1.5 接觸酶測量技術(shù)

接觸酶測量是在裝有H202的試管中，放置一個含有接觸酶的紙盤，通過計算紙盤漂浮的時間來對微生物進(jìn)行合理預(yù)估。紙盤上浮時間短，說明接觸酶含量高；反之，接觸酶含量低。自然界中大多數(shù)腐敗微生物是嗜冷性細(xì)菌，而大多數(shù)嗜冷細(xì)菌的接觸酶呈陽性，因此該方法可以應(yīng)用于檢測食品中的腐敗微生物。

3.1.6 快速酶觸反應(yīng)技術(shù)

快速酶觸反應(yīng)技術(shù)是根據(jù)特異性微生物在生長繁殖過程中可合成或釋放特異性酶的原理進(jìn)行檢測，選用與特異性酶的特性相適應(yīng)的底物或指示劑進(jìn)行反應(yīng)，以此鑒定微生物。該方法應(yīng)用范圍較廣。例如，Biolog微生物鑒定系統(tǒng)[11]是根據(jù)微生物對95種不同碳源代謝率的特異性差別，并與標(biāo)準(zhǔn)菌株對比進(jìn)行鑒定。

3.2 生物傳感器技術(shù)

3.2.1 光學(xué)傳感器

光學(xué)傳感器是在培養(yǎng)基中預(yù)加指示劑后，微生物代謝的特異性產(chǎn)物與指示劑反應(yīng)后，會使培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，這種顏色變化再由光學(xué)檢測器檢測、計算，得出特征性數(shù)據(jù)，以達(dá)到檢測微生物的目的。這種方法簡便、快速、成本較低，但只適用于檢測能產(chǎn)生熒光素的細(xì)菌，且靈敏度不高。例如，梅里BacT/Alert微生物檢測儀、NHD公司的手持式大腸類細(xì)菌快速檢測系統(tǒng)和BioLumix公司的實(shí)時微生物快速熒光光電檢測儀，都是基于此原理進(jìn)行檢測的。

3.2.2 生物發(fā)光傳感器

ATP生物發(fā)光法是由生物體內(nèi)的ATP和熒光素酶催化熒光素與氧結(jié)合，熒光素分子中的電子躍遷發(fā)出熒光，而在一定范圍內(nèi)，熒光濃度與ATP濃度呈線性關(guān)系，可通過光度計對熒光素的熒光強(qiáng)度來檢測菌體的數(shù)量。從應(yīng)用實(shí)踐來看，該技術(shù)具有省時、簡便性，多應(yīng)用在大量食品樣本的檢測、現(xiàn)場檢測等領(lǐng)域。自動ATP生物熒光技術(shù)已廣泛應(yīng)用于乳制品工業(yè)中，如生乳活菌數(shù)檢測、設(shè)備清潔度的評估及成品架售期的推算等。

3.2.3 電化學(xué)傳感器

電化學(xué)傳感器是微生物通過利用低電導(dǎo)率的大分子物質(zhì)進(jìn)行新陳代謝，生成高電導(dǎo)率的小分子物質(zhì)，使培養(yǎng)基的電導(dǎo)率發(fā)生變化，再以電信號的變化檢測微生物。此技術(shù)特點(diǎn)是成本低，效率高。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測，例如，微生物自動快速檢測系Bac- Trac4300，在檢測中沒有出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3.2.4 免疫傳感器

免疫傳感器是結(jié)合免疫學(xué)與傳感器的新技術(shù)，在結(jié)構(gòu)上由生物敏感元件、信號轉(zhuǎn)換器和信號數(shù)據(jù)處理器3部分構(gòu)成。當(dāng)待測微生物的特異性分子與識別元件特異性結(jié)合后，產(chǎn)生的復(fù)合物可通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘柣蚬庑盘枺⑼ㄟ^信號數(shù)據(jù)處理器進(jìn)行分析，以達(dá)到檢測的目的。該方法應(yīng)用范圍較廣。據(jù)報道，采用電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)檢測大腸桿菌O157∶H7，可以在10 min內(nèi)完成[12]。

4 快速測試片

快速測試片是將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在紙片、紙膜、膠片等載體上，通過微生物的生長過程中產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物、并顯出特異性顏色來檢測食品中微生物。該方法具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，易于保存、運(yùn)輸，減少對環(huán)境的污染、試驗(yàn)前準(zhǔn)備工作以及試驗(yàn)后的清洗工作。近年來以濾紙、美國3M公司的Petrifilm和無紡布為載體的測試片，在檢測菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等菌體時，具有操作簡便且檢出率較高的特點(diǎn)，且與傳統(tǒng)方法相比在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異，現(xiàn)已開始被廣泛應(yīng)用[13]。

5 分析化學(xué)技術(shù)

現(xiàn)已有很多儀器分析方法，如高效液相色譜、氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜儀以及液相色譜-質(zhì)譜儀等，在食品微生物檢測鑒定中廣泛應(yīng)用[14]。這些方法是通過分析微生物的化學(xué)組分進(jìn)行鑒定的，是一種新型微生物檢測手段。目前，應(yīng)用和研究最多的是氣相色譜技術(shù)。該方法首先是通過微生物裂解；其次，用甲醇分解、提取化學(xué)組分；再進(jìn)行硅烷化、甲基化等衍生化處理，使特異性化學(xué)組分分離，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、建立標(biāo)準(zhǔn)色譜圖庫，將待鑒定微生物譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖相比較，來鑒定微生物[15]。該技術(shù)可應(yīng)用于海產(chǎn)品腐敗菌的快速檢驗(yàn)、革蘭氏陽性菌的檢測、發(fā)酵型食品的菌種檢驗(yàn)、動物源雙歧桿菌亞種的分類鑒定等[16]。

6 結(jié)語

目前我國食品安全問題較為突出，而控制食品安全的首要措施是提高監(jiān)測手段，因此，快速篩查技術(shù)在未來會有良好的研究價值和應(yīng)用前景。而微生物快速篩查技術(shù)經(jīng)過了長期探究及發(fā)展，已經(jīng)進(jìn)入快速、靈敏且儀器化的發(fā)展階段。但是，由于我國對該技術(shù)的研究起步晚、發(fā)展速度慢，該技術(shù)水平急需提升。各類學(xué)科技術(shù)的相互交叉、融合，以及降低先進(jìn)技術(shù)的成本是未來科研工作者的研究重點(diǎn)。

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作者簡介：宋爽（1990—），女，山東德州人，碩士。研究方向：食品微生物。