煙區(qū)土壤高效氨化芽孢桿菌菌株的篩選鑒定及特性研究

劉尚 張紅 張乾申 龔影 韓麗珍

摘 ?要：為提高有機肥中有機氮的分解效率，滿足烤煙生長前期氮素需求，利用氨化細菌培養(yǎng)基從貴州煙區(qū)土壤中分離、純化獲得了5株氨化細菌菌株，通過納氏試劑比色法測定培養(yǎng)液中的氨氮濃度，5株菌株的氨氮產量在297～460 mg/L之間;篩選出氨化作用最強的2株菌株，通過形態(tài)、生理生化特征、16S rRNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定AMM-2菌株為Bacillus toyonensis，AMM-5為Bacillus mobilis。氨化特性研究顯示，在pH 7.0的氨化細菌培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，2株菌產生的NH4+-N濃度分別可達514和505 mg/L，在pH 4.0～10.0和25～30 ℃溫度范圍內均表現(xiàn)較強的氨化能力，其中AMM-5菌株的溫度適應性更廣、耐鹽性更高。研究獲得了分解有機氮能力強的芽孢桿菌菌株，為提高有機肥的肥效提供了菌株資源。

關鍵詞：氨化細菌;芽孢桿菌;鑒定;氨化特性

Screening， Identification and Ammoniation Features of High Effective Ammonifying Bacillus Strains Isolated from Tobacco-planted Soils

LIU Shang， ZHANG Hong， ZHANG Qianshen， GONG Ying， HAN Lizhen*

（College of Life Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract： In order to improve decomposition efficiency of organic nitrogen in organic fertilizer and meet the nitrogen requirement of tobacco at the early growth stage， five ammonifying bacterial strains were isolated and purified from tobacco-planted soil in Guizhou using ammoniated bacterium medium. The NH4+-N concentrations in ammoniated medium of five strains were between 297 mg/L and 460 mg/L by the measurement of Nesslers reagent method. Two ammonifying strains AMM-2 and AMM-5， with the highest ammonifying ability were identified as Bacillus toyonensis and Bacillus mobilis， respectively， based on the morphological characteristics， physiological and biochemical identification， 16S rRNA gene sequencing and phylogenetic tree analysis. After incubation for 48 h at 30 ℃， the NH4+-N concentrations of AMM-2 and AMM-5 in ammoniated medium （pH 7.0） were 514 mg/L and 505 mg/L ， respectively. Good ammonifying abilities of the two ammonifying strains were observed under the condition of pH 4.0-10.0 and temperature 25-30 ℃， respectively. Comparing with AMM-2， AMM-5 showed the wider temperature adaptation and higher salt tolerance. The two Bacillus strains with high organic nitrogen decomposition ability， obtained in this study could provide desirable strain resources for enhancing manurial effect of organic fertilizer.

Keywords： ammonifying bacterium; Bacillus spp.; identification; ammonifying features

煙草是我國重要的經濟作物，適宜的植煙土壤是優(yōu)質煙葉生產的關鍵。施肥是烤煙生產實踐中重要的環(huán)節(jié)，施肥對煙葉產量產值的貢獻率可分別達到39.19%和47.28%[1]，但是大量施用化肥會導致土壤結構變差，有機質含量下降，微生物活性降低，從而造成土壤環(huán)境惡化[2]。研究報道有機肥可以改善植煙土壤的理化性質及微生態(tài)結構，提高土壤肥力和肥料利用率[3]。然而在貴州，植煙土壤一般比較黏重，烤煙生長前期低溫多雨，增施有機肥后土壤氮素的生物有效性不高，難以滿足烤煙前期生長的需要[4]。如何在降低化肥使用量的同時，提高有機肥氮素的利用效率顯得尤為重要。土壤微生物的參與是促進氮素形態(tài)轉化的重要因素，氨化細菌是土壤氨化作用進行的重要參與者，它可以將土壤中的有機氮分解產生NH3，其活性和數(shù)量在一定程度上反映了土壤有效氮和銨態(tài)氮的供應能力[5-6]。研究顯示烤煙連作土壤中氨化細菌數(shù)量減少，有機氮的礦化作用被減弱，土壤供氮能力下降，導致烤煙產量與品質明顯下降[7]。為了滿足烤煙生長前期對無機氮的需求，可以分離篩選分解有機氮效果較強的微生物菌劑，調控土壤中無機氮的釋放[8]。

目前對氨化細菌的研究大多集中在不同水體氨化細菌的分離及水體氨氮污染的治理方面，而從土壤中分離篩選氨化細菌的研究報道較少。本項目組前期從貴州植煙土壤中獲得多株氨化細菌，室內有機肥培養(yǎng)試驗結果表明，部分菌株接種的有機肥中，無機氮含量明顯提高[8]。本研究對貴州煙區(qū)混合土樣中分離獲得的5株氨化菌株進行氨化能力的動態(tài)監(jiān)測，從中篩選到2株高效的氨化細菌并進行鑒定，探討環(huán)境因素對菌株氨化能力的影響，為下一步有機氮分解菌劑的制備奠定基礎，為施用有機肥后植煙土壤有機氮的分解調控提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?土樣采集 ?于2017年7—8月（煙草旺長期）采集貴州省遵義地區(qū)湄潭縣抄樂鄉(xiāng)、畢節(jié)地區(qū)威寧縣黑石鎮(zhèn)煙區(qū)黃壤等量混合后，置于4 ℃冰箱保存，用于分離篩選氨化細菌。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?LB及氨化細菌培養(yǎng)基參考文獻[9]。

1.2 ?方法

1.2.1 ?氨化細菌的分離及初篩 ?取適量植煙土壤加入無菌生理鹽水中振蕩混勻后，經梯度稀釋和氨化細菌固體培養(yǎng)基平板涂布分離純化氨化細菌菌株并保存。過夜活化菌株轉接入氨化細菌液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 d后，取少量培養(yǎng)液加入納氏試劑定性檢測進行初篩。

1.2.2 ?高效氨化細菌菌株的復篩 ?初篩獲得的氨化細菌菌株于氨化細菌液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)72 h，每8 h取樣1次，測定培養(yǎng)液OD600值;培養(yǎng)液經4000 r/min 離心后，取上清經納氏試劑分光光度法測定氨氮濃度[10]。

1.2.3 ?高效氨化細菌菌株的鑒定 ?采用形態(tài)及生理生化試驗、分子鑒定進行鑒定。以LB瓊脂平板劃線觀察菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢觀察細胞形態(tài)進行形態(tài)學特征描述，生理生化實驗參照文獻[11]。

分子鑒定通過對菌株的16S rRNA基因測序分析進行。利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA后，以16S rRNA基因通用引物對27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增[12]。PCR產物送上海英駿生物工程有限公司測序，測序結果在Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫和NCBI上進行相似性序列比對，挑選相似性較高的模式菌株，以MEGA 5.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 ?溫度對高效氨化細菌菌株氨化能力的影響 ?設置4個培養(yǎng)溫度，分別為25、30、35及40 ℃，將高效氨化細菌菌株接入氨化細菌液體培養(yǎng)基中、不同溫度條件下振蕩培養(yǎng)48 h，測定培養(yǎng)液中 NH4+-N濃度。

1.2.5 ?pH對高效氨化細菌菌株氨化能力的影響 ?調節(jié)氨化細菌液體培養(yǎng)基pH分別為4.0～10.0，將菌株接入不同pH的氨化培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，測定培養(yǎng)液NH4+-N濃度。

以上實驗均以未接種的氨化細菌培養(yǎng)基為空白對照，對照及實驗組均設3個重復。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件進行分析，使用Duncan法進行組間差異顯著性檢驗。

2 ?結 ?果

2.1 ?氨化細菌的分離及初步篩選

在氨化細菌固體培養(yǎng)基生長良好的單菌落，經納氏試劑定性分析，初步篩選出5株具氨化能力的菌株，分別命名為AMM-1、AMM-2、AMM-4、AMM-5、AMM-6。

2.2 ?5株氨化細菌菌株的氨化能力及生長曲線的測定

5個菌株產氨氮的能力隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增強，大多數(shù)菌株在培養(yǎng)48～64 h之間達到最大值（圖1）。不同菌株的氨化能力存在差異，AMM-1和AMM-4菌株32 h培養(yǎng)液的氨氮濃度最高、分別為312和297 mg/L;此時，AMM-6培養(yǎng)液的氨氮含量才開始逐漸增高;菌株AMM-2培養(yǎng)48 h的氨氮含量為413 mg/L，AMM-5菌株64 h培養(yǎng)液中的氨氮含量達460 mg/L，是兩株產氨氮能力較強的菌株。

菌株在氨化培養(yǎng)基中的生長曲線如圖2。AMM-6菌株的生長較緩慢，56 h后由對數(shù)期進入穩(wěn)定生長階段;而其余4株菌均在培養(yǎng)24 h后進入穩(wěn)定期。結合不同菌株產氨氮的能力（圖1），在對數(shù)生長期（24 h以內），AMM-1、AMM-2、AMM-

4及AMM-5等4個菌株培養(yǎng)液中的氨氮濃度隨著OD600值的升高而快速增加，菌株的氨化能力在此時期表現(xiàn)突出;當進入穩(wěn)定期后，AMM-2和AMM-5產氨氮量仍在緩慢增長。而對于AMM-6菌株，前期培養(yǎng)過程中雖有菌體的生長，但幾乎未檢測到氨氮生成，直至32 h后氨氮含量才呈逐漸上升。綜合菌體的生長曲線及產氨氮能力，選擇AMM-2和AMM-5進一步研究。

2.3 ?高效氨化細菌菌株的鑒定

形態(tài)學觀察表明（圖3），菌株AMM-2的菌落為表面粗糙的乳白色不透明狀，中心呈點狀突起、邊緣不規(guī)則，鏡檢為G+的桿狀細菌、中生芽孢。AMM-5菌落呈灰白色、不透明的橢圓形，鏡檢也表現(xiàn)為G+、中生芽孢的桿狀細菌。生理生化試驗結果（表1）顯示，2株菌均具有運動性，V.P.試驗及硝酸鹽還原陽性，可在5% NaCl濃度下生長;但AMM-2菌株可利用海藻糖、甘油及果糖，而AMM-5菌株在高達7% NaCl環(huán)境中生長良好。

對16S rRNA基因測序結果進行比對，發(fā)現(xiàn)AMM-2、AMM-5與多株Bacillus sp.的相似性較高（表2），選擇芽孢桿菌屬相關種的模式菌株與這2株菌構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），2個菌株分別與相似性最高的模式菌株位于同一發(fā)育地位。根據(jù)生理生化鑒定結果、參考JIM?NZE等[13]以及LIU等[14]對于芽孢桿菌屬不同近似種的鑒定依據(jù)，并結合分子鑒定結果，判定AMM-2為Bacillus toyonensis、AMM-5為Bacillus mobilis。

2.4 ?培養(yǎng)溫度對2個菌株產氨氮能力的影響

如圖5所示，當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，AMM-2的產氨氮能力顯著高于其余溫度（p<0.05），此時培養(yǎng)液中的氨氮含量為514 mg/L;AMM-5菌株產氨氮最高的溫度為30 ℃，但與25 ℃條件下差異不顯著。當培養(yǎng)溫度為35 ℃時，2菌株培養(yǎng)液中的氨氮濃度分別降低至最適溫度下的20.23%和60.20%，AMM-5菌株產氨氮能力具有更廣的溫度適應性。

2.5 ?培養(yǎng)液pH對2個菌株產氨氮能力的影響

AMM-2和AMM-5菌株在pH 7.0時的產氨氮能力顯著高于其余pH條件（p<0.05）;當pH降低至4.0時，兩菌株產生的氨氮濃度分別為pH 7.0時的83.66%和90.89%;而pH升高至10.0時的氨氮濃度分別為最適pH時的71.79%和77.62%（圖6）。顯然，2個菌株的產氨氮能力具有很廣的pH適應性。

3 ?討 ?論

近年來文獻報道的氨化細菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、沙雷氏菌屬（Serratia sp.）、產堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）等[15]，從不同環(huán)境中分離的多個種屬的氨化細菌菌株，氨化能力存在一定差異。從茶園土壤分離到的3株氨化菌株分別為芽孢桿菌屬、微小桿菌屬和不動桿菌屬，振蕩培養(yǎng) 10 h后的NH4+-N含量分別為141、68和83.5 mg/L[16]。從煙葉中篩選出的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）和副短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）菌株，48 h的發(fā)酵液中NH4+-N含量為50、56.1和41.9 mg/L[17]。從廢硅藻土中篩選出的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌BSD1菌株的氨氮量為232.2 mg/L[18]。與上述報道相比，本研究獲得的2株芽孢桿菌菌株具有更強的氨化能力。此外，研究顯示pH會影響有機氮的降解能力，低于最適pH時，氨化活性明顯降低[9，19]。AMM-2和AMM-5菌株在pH 4.0～10.0范圍內均具有較強的氨化能力，該特征使得菌株具有用于高濃度氨氮廢水處理的潛力。

對5株氨化細菌的生長曲線及氨化能力的動態(tài)測定發(fā)現(xiàn)，除AMM-6外，其余4株菌產氨氮速度最快的時期是菌株的對數(shù)生長期。據(jù)報道從餐廚垃圾中分離到的Bacillus amyloliquefaciens DT菌株，對數(shù)生長期的OD600值與其氨化活性呈現(xiàn)相關性[20]。類似的結果也被ZHANG等[21]報道，因而，大多數(shù)氨化菌株的生長與氨氮的降解是同步進行的。特別的是，AMM-6菌株的氨氮量在對數(shù)生長后期（32 h后）才開始明顯增高，且穩(wěn)定期的產氨氮速度高于對數(shù)生長期，其原因有待于研究。

目前我國烤煙生產中氮素管理主要存在兩大問題，一是施氮量過大，易導致煙葉品質下降;二是氮肥施肥基追比與烤煙根系吸氮規(guī)律不吻合[22]。合理配施有機肥可以提高烤煙產量和質量[23]。微生物參與下的有機肥分解可以加速無機態(tài)氮素的釋放速率。氨化過程是氮素礦化（有機氮轉化為銨態(tài)氮、硝態(tài)氮過程）的第一步，也是植物可利用氮素供應的關鍵一步[24]。本研究從煙區(qū)土壤中分離篩選到的2株菌株，具有很強的產氨氮能力，在較廣的pH范圍內，氨化能力仍可維持一定水平。利用該菌株研發(fā)微生物有機肥，可明顯提高有機氮的分解速率。此外，芽孢桿菌是一類重要的微生物菌種資源，因其能產生芽孢及促生機制多樣性，在生物肥料和生物農藥等領域受到廣泛關注。國內外報道的植物根際促生菌以芽孢桿菌屬占優(yōu)勢，接種試驗表明部分菌株有顯著提高煙草的株高和鮮重，改善烤煙的農藝性狀及煙葉的化學品質，降低烤煙發(fā)病率的作用[25-27]。因而，本研究從健康煙草種植土壤獲得的2株芽孢桿菌是否具有促生抗病性能，值得進一步研究并挖掘其應用潛力。

4 ?結 ?論

從貴州不同煙區(qū)的混合土樣中分離到5株氨化細菌，產氨氮濃度在297～460 mg/L之間，通過氨化能力及生長曲線的動態(tài)測定，篩選出氨化作用最強的2株菌株;通過形態(tài)學、生理生化及分子生物學方法進行鑒定，將AMM-2鑒定為Bacillus toyonensis，AMM-5菌株鑒定為Bacillus mobilis。在pH 7.0氨化細菌培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，2株菌產生的NH4+-N濃度分別可達514和505 mg/L;在pH 4.0～10.0，溫度25～30 ℃范圍內均表現(xiàn)較強的氨化能力，但AMM-5菌株的溫度適應性更廣、耐鹽性更高。研究為提高有機肥的肥效提供了菌株資源，對2個菌株是否具有促生功能的探究將有助于拓展其應用的范圍。

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基金項目：貴州省煙草公司科技項目“原位氮代謝功能菌肥研發(fā)與運用”（201707）;貴州大學SRT計劃項目“氮代謝功能菌的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化”{貴大SRT字[2017]110號}

作者簡介：劉 ?尚（1999-），男，本科生，研究方向：土壤微生物學。E-mail：liushang222@qq.com。*通信作者，E-mail：hanlizhen11@163.com.

收稿日期：2019-08-25 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?修回日期：2019-11-08