產(chǎn)細(xì)菌素益生菌
——枯草芽孢桿菌HJD.A32生物學(xué)特性研究

賈麗艷 高娟娟 荊 旭 田宇敏 郭晉田 郝 林

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801 2 山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心 山西太谷030801）

益生菌具有改善機(jī)體胃、腸道微生態(tài)菌群，抑制胃、腸道致病菌的入侵，調(diào)節(jié)免疫，提高食物利用率和促進(jìn)生長(zhǎng)等生物學(xué)功能[1]。作為益生菌一般具備以下條件：對(duì)宿主有益，無(wú)毒副作用，無(wú)致病性；對(duì)胃酸和膽鹽具有耐受性，能存活于消化道；可定植于消化道表面，能夠產(chǎn)生有用的酶類和代謝物；在加工和貯存過(guò)程中能保持活性[2]?？莶菅挎邨U菌是一類食品級(jí)安全的益生菌，存在于多種傳統(tǒng)釀造食品（傳統(tǒng)山西醋、豆瓣醬）的發(fā)酵過(guò)程中，并發(fā)揮著重要的作用[3-4]。與其它益生菌相比，具有耐高溫、耐干燥以及穩(wěn)定、便于運(yùn)輸和保存的特性，具有研究和開發(fā)的價(jià)值。

山西老陳醋是我國(guó)四大名醋之一，具有悠久的發(fā)展史，其食用安全，風(fēng)味獨(dú)特[5]。微生物對(duì)山西老陳醋的發(fā)酵生產(chǎn)及品質(zhì)具有重要的作用，挖掘山西老陳醋醋醅中的微生物菌種資源，對(duì)促進(jìn)山西食醋及相關(guān)微生態(tài)制劑的發(fā)展具有重要意義。

山西老陳醋醋醅中含有多種功能性微生物，枯草芽孢桿菌是其中的一類主要的功能性菌株[6-7]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HJD.A32 是從山西老陳醋醋醅中篩選出的一株能產(chǎn)廣譜抑菌細(xì)菌素的菌株，可抑制多種食源性有害微生物的生長(zhǎng)，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等[8]，具有優(yōu)化生物個(gè)體內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)的潛能，以及作為益生菌開發(fā)的價(jià)值。本研究采用酶學(xué)方法、分光光度法和牛津杯法對(duì)分離自山西老陳醋新鮮醋醅的產(chǎn)細(xì)菌素枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為該菌株作為益生菌微生態(tài)制劑的開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 枯草芽孢桿菌HJD.A32，分離自山西老陳醋的新鮮醋醅。

1.1.2 主要試劑和儀器 試劑：胰蛋白酶（2 000～5 000 U/mg）、胃蛋白酶（3 000～3 500 U/mg），北京solarbio 公司。其它化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

設(shè)備與儀器：高速低溫離心機(jī)（Centrifuge5417 R），德國(guó)Eppendorf 公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-GF101-3-BS-Π/H），上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；pH 計(jì)（PHS-4A），上海精密科學(xué)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9272MBE），上海博訊；可見分光光度計(jì)（722G），上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）發(fā)酵培養(yǎng)液[8]葡萄糖10 g，酵母浸膏10 g，蒸餾水1 000 mL。

2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[9]NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4。

3）麩皮固態(tài)培養(yǎng)基 將20 g 麩皮、20 mL 水加入到250 mL 的三角瓶中，混勻后，將其置于121 ℃、0.1 MPa 條件下，滅菌20 min，冷卻至室溫，備用[10]。

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)曲線的建立按4%接種量將活化的枯草芽孢桿菌HJD.A32 接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，分別在30，37，40，45，50，55℃條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌HJD.A32，每隔6 h 測(cè)定發(fā)酵液的OD600值。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)酶性能的測(cè)定 將枯草芽孢桿菌HJD.A32 接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于發(fā)酵培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)24 h，然后以4%的接種量轉(zhuǎn)接到麩皮固態(tài)培養(yǎng)基上，混勻，分別于30，35，40，45，50 ℃和55 ℃的條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力。液化酶活力的測(cè)定采用碘量法[11]。液化酶活力單位定義：1 g 絕干重發(fā)酵麩皮固態(tài)培養(yǎng)基制備成的粗酶液，在35 ℃、pH 4.6 的條件下，1 h 液化1 g可溶性淀粉，為1 個(gè)液化酶活力單位，以U/g 表示。糖化酶活力的測(cè)定采用DNS 法[12]。酶活力單位定義：1 g 絕干重發(fā)酵麩皮固態(tài)培養(yǎng)基制備成的粗酶液，在40 ℃，pH 4.6 條件下，1 h 分解可溶性淀粉，產(chǎn)生1 mg 葡萄糖的酶量，為1 個(gè)糖化酶活力單位，以U/g 表示。蛋白酶活力的測(cè)定采用福林-酚法[13]。酶活力單位定義：1 g 絕干重發(fā)酵麩皮固態(tài)培養(yǎng)基制備成的粗酶液，在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸，定義為1 個(gè)蛋白酶活力，單位以U/g 表示。

1.2.3 液態(tài)發(fā)酵枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)酶性能的測(cè)定 將枯草芽孢桿菌HJD.A32 接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于發(fā)酵培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)24 h，然后以4%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)液中，分別在30，35，40，45 ℃和50℃的條件下培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液上清液，測(cè)定酶活力。液化酶活力的測(cè)定采用碘量法[11]。酶活力單位定義：1 g 發(fā)酵液上清液，在35 ℃、pH 4.6 的條件下，1 h 液化1 g 可溶性淀粉，定義為1 個(gè)液化酶活力單位，以U/g 表示。糖化酶活力的測(cè)定采用DNS 法[12]。酶活力單位定義：1 g 發(fā)酵液上清液，在40 ℃，pH 4.6 條件下，1 h 分解可溶性淀粉，產(chǎn)生1 mg 葡萄糖的酶量，定義為1 個(gè)糖化酶活力單位，以U/g 表示。蛋白酶活力的測(cè)定采用福林-酚法[13]。酶活力單位定義：1 g 發(fā)酵液上清液，在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力，單位以U/g 表示。

1.2.4 枯草芽孢桿菌HJD.A32 鹽耐受性的測(cè)定將NaCl 分別加入發(fā)酵培養(yǎng)液中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%，1%，2%，4%，5%，7%，8%，10%，121 ℃，0.1 MPa 滅菌20 min。將活化后的枯草芽孢桿菌HJD.A32 按4%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，30℃，147 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 后，測(cè)定發(fā)酵液的OD600值。

1.2.5 枯草芽孢桿菌HJD.A32 膽鹽耐受性的測(cè)定將豬膽鹽加入發(fā)酵培養(yǎng)液中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1%，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。將活化的枯草芽孢桿菌HJD.A32 按4%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，30 ℃，147 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD600值。

1.2.6 枯草芽孢桿菌HJD.A32 表面活性劑耐受性的測(cè)定 將表面活性劑分別加入發(fā)酵培養(yǎng)液中，使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%，0.4%、，0.6%，0.8%，1.0%。將活化的枯草芽孢桿菌HJD.A32 按4% 接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，30 ℃，147 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD600值。表面活性劑包括脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（AES）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、吐溫20、吐溫80、十二烷基苯磺酸鈉（LAS）。

1.2.7 枯草芽孢桿菌HJD.A32 熱耐受性的測(cè)定將活化的枯草芽孢桿菌HJD.A32 按4%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，分別于60，70，80，90，100 ℃條件下水浴5 min，在30 ℃，147 r/min 條件下培養(yǎng)72 h，每隔6 h 測(cè)定發(fā)酵液的OD600值。

1.2.8 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)胃液耐受性的測(cè)定 分別取pH 2.5，3.0，3.5 的鹽酸溶液50 mL 于三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。冷卻至50 ℃以下加入1%的胃蛋白酶，混勻，備用。將過(guò)夜培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌HJD.A32 溶液離心，取沉淀菌體于三角瓶中，培養(yǎng)，每間隔30 min 測(cè)定培養(yǎng)液OD600值。

1.2.9 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)腸液耐受性的測(cè)定 取100 mL 0.68% KH2PO4溶 液，121 ℃，0.1 MPa 滅菌20 min，冷卻至30 ℃，加入1%胰蛋白酶，混勻，備用。將過(guò)夜培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌HJD.A32 離心后，取其沉淀菌體于三角瓶中，培養(yǎng)，每隔30 min 測(cè)定培養(yǎng)液OD600值[14]。

1.2.10 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)抗生素類藥物耐受性的測(cè)定 采用雙層牛津杯法[15]測(cè)定枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)抗生素類藥物的耐受性。將15 mL 融化的牛肉高蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固。將融化的牛肉高蛋白胨培養(yǎng)基冷卻到50℃，按0.8%接種量加入活化的枯草芽孢桿菌HJD.A32，混勻，倒于已凝固的培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿半敞口，靜置于超凈臺(tái)上，待其凝固40 min 后蓋上皿蓋。在培養(yǎng)基表面垂直放上已滅菌的牛津杯，輕輕按壓，向牛津杯中加入200 μL 無(wú)菌抗生素溶液，4℃，靜置12 h，30 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌HJD.A32 的產(chǎn)酶性能

2.1.1 枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)液化酶的能力不同的發(fā)酵方式對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)酶性能有一定的影響。由圖1可知，枯草芽孢桿菌HJD.A32 麩皮固態(tài)發(fā)酵比液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)液化酶能力強(qiáng)。當(dāng)30 ℃培養(yǎng)時(shí)，枯草芽孢桿菌HJD.A32 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)液化酶活力高達(dá)4.43 U/g。培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)條件影響枯草芽孢桿菌的代謝，麩皮中含有≥12%的淀粉，促使枯草芽孢桿菌產(chǎn)生液化酶。液態(tài)培養(yǎng)基中淀粉含量低，使得枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)酶能力不高。此外，溫度對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)液化酶能力也有一定的影響，隨著培養(yǎng)溫度的升高，枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)液化酶的能力降低。

2.1.2 枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)糖化酶的能力由圖2可知，枯草芽孢桿菌HJD.A32 麩皮固態(tài)發(fā)酵比液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶能力強(qiáng)。當(dāng)30 ℃培養(yǎng)時(shí)，枯草芽孢桿菌HJD.A32 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力高達(dá)1 874.23 U/g。此外，溫度對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)糖化酶能力也有一定的影響，隨著培養(yǎng)條件的升高，枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)糖化酶的能力降低。

圖1 固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵條件下枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)液化酶的活力Fig.1 The ability of liquefaction produced by B.subtilis HJD.A32 in the solid fermentation or the liquid fermentation

圖2 固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵條件下枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)糖化酶活力Fig.2 The activity of glucoamylase produced by B.subtilis HJD.A32 in the solid fermentation or the liquid fermentation

2.1.3 枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)蛋白酶的能力由圖3可知，枯草芽孢桿菌HJD.A32 固態(tài)發(fā)酵比液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的能力強(qiáng)，最高產(chǎn)蛋白酶活力達(dá)181.91 U/g。發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32產(chǎn)蛋白酶的能力有一定的影響。當(dāng)溫度30～45 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，蛋白酶活力基本不變；當(dāng)培養(yǎng)溫度45～55 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高產(chǎn)蛋白酶能力逐漸降低。

2.2 枯草芽孢桿菌HJD.A32 的環(huán)境耐受性

2.2.1 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)曲線的影響

由圖4可知，當(dāng)溫度30～50 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)繁殖曲線趨勢(shì)相似，即在0～24 h 時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，處于延緩期；在24～48 h 時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率最快；在48 h 時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率放緩，而生物量還在增加，處于穩(wěn)定期；48 h 后生物量開始下降，進(jìn)入衰亡期。隨著溫度的升高，最高OD600值逐漸變低，表明菌株的生長(zhǎng)繁殖速度受到溫度的影響。當(dāng)溫度55 ℃時(shí)，生長(zhǎng)曲線趨于一條直線，表明55 ℃時(shí)枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生長(zhǎng)繁殖完全被抑制。

圖3 固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵條件下枯草芽孢桿菌HJD.A32 產(chǎn)蛋白酶活力Fig.3 The activity of protease produced by B.subtilis HJD.A32 in the solid fermentation or the liquid fermentation

圖4 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32生長(zhǎng)曲線的影響Fig.4 The growth curve of B.subtilis HJD.A32 at different culture temperatures

2.2.2 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)鹽的耐受性 滲透壓影響微生物的生長(zhǎng)、繁殖，滲透壓過(guò)高時(shí)，使微生物發(fā)生質(zhì)壁分離而死亡。NaCl 溶于水會(huì)引起溶液滲透性升高，抑制菌體的生長(zhǎng)，具有抑菌、殺菌的功能[16]。由圖5可知，隨著NaCl 含量的增加，枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，OD600值為0.06；當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%～10%時(shí)，OD600值為0.02，表明菌體幾乎不生長(zhǎng)，由此推斷，菌體最高耐受NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，具有較強(qiáng)的鹽耐受性。

2.2.3 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)膽鹽的耐受性由圖6可知，隨著膽鹽濃度的增長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生長(zhǎng)繁殖受到不同程度的抑制。當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，OD600值為0.039，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)受到較大的抑制，菌體最高可耐受的膽鹽濃度為1.0%。益生菌在腸道發(fā)揮益生作用，需經(jīng)受住小腸液對(duì)它的破壞才能在動(dòng)物胃、腸道中存活和增殖，十二指腸中的膽汁酸鹽對(duì)外源細(xì)菌有抑制作用，菌體只有具備較高的膽鹽耐受性才能保持足夠的活菌數(shù)，從而發(fā)揮益生作用[17]。一般情況下，腸道膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%左右。為此，枯草芽孢桿菌HJD.A32 能夠適應(yīng)腸道膽鹽環(huán)境，可在其中生長(zhǎng)繁殖。

圖5 NaCl 對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 的影響Fig.5 Effect on NaCl to B.subtilis HJD.A32

圖6 膽鹽對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 的影響Fig.6 Effect on bile salt to B.subtilis HJD.A32

2.2.4 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)表面活性劑的耐受性 為了保證微生態(tài)制劑的品質(zhì)，在微生態(tài)制劑的制備過(guò)程中，往往需要添加一些乳化劑或表面活性劑，如吐溫20、吐溫80、司本80、SDS 等，研究菌株對(duì)這些化學(xué)試劑的耐受性，對(duì)微生態(tài)制劑的開發(fā)利用具有重要意義。由圖7可知，不同種類和濃度的表面活性劑或乳化劑對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)有不同的影響，當(dāng)表面活性劑或乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)，LAS 和AES 促進(jìn)枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生長(zhǎng)，吐溫80 和吐溫20 對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)無(wú)影響，SDS 抑制枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生長(zhǎng)；當(dāng)表面活性劑或乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.4%～0.6%時(shí)，LAS 和AES 對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)的促進(jìn)作用逐漸降低，吐溫80、吐溫20 和SDS 對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)；當(dāng)表面活性劑或乳化劑濃度≥0.8%時(shí)，表面活性劑對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制作用?？傊?，表面活性劑或乳化劑對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)，在一定濃度范圍內(nèi)有抑制作用，抑制效果依次為SDS＞吐溫20＞吐溫80＞LAS＞AES。

2.2.5 枯草芽孢桿菌HJD.A32 的高溫耐受性 微生物制劑制備過(guò)程中往往需要干燥處理，以防雜菌污染和便于保存，然而，不同的干燥溫度影響微生物制劑活菌存活率。由圖8可知，隨著處理溫度的升高，枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，100 ℃處理5 min，菌體仍可生長(zhǎng)繁殖，達(dá)到較高的OD600值，表明其對(duì)高溫具有一定的耐受性。

圖7 表面活性劑或乳化劑對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 的影響Fig.7 Effect on different surfactants or emulsifier to B.subtilis HJD.A32

圖8 高溫對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 的影響Fig.8 Effect on high temperature to B.subtilis HJD.A32

2.2.6 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)胃液的耐受性人體胃液的pH 值一般在3 左右，具有很強(qiáng)的殺菌能力。它是益生微生態(tài)制劑進(jìn)入腸道發(fā)揮功能必經(jīng)的一道屏障。本試驗(yàn)?zāi)M胃液環(huán)境，建立了不同pH 值的人工胃液，研究胃液環(huán)境對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖9。隨著pH 值的降低，OD600值越來(lái)越低，表明胃液環(huán)境對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)有一定的抑制作用。OD600值較初始值升高，表明在低酸胃液環(huán)境下芽孢桿菌能生長(zhǎng)，具有一定的耐受性。

2.3.7 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)腸液的耐受性小腸是益生菌發(fā)揮功能的場(chǎng)所，小腸內(nèi)含有保持一定數(shù)量的活菌數(shù)是益生菌發(fā)揮作用的必要條件。小腸液是影響益生菌數(shù)量的主要因素。本試驗(yàn)?zāi)M腸液的條件，研究枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)腸液的耐受性，結(jié)果見圖10。小腸液對(duì)枯草芽孢桿菌HJD.A32 的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。這與郭小華等[18]對(duì)兩株益生芽孢桿菌的研究相似。芽孢桿菌在模擬腸液中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，芽孢桿菌能夠適應(yīng)并在這種環(huán)境中繁殖，

圖9 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)胃液的耐受性Fig.9 Tolerance on gastric juice to B.subtilis HJD.A32

圖10 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)腸液的耐受性Fig.10 Tolerance on intestinal juice to B.subtilis HJD.A32

2.2.8 枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)抗生素的耐受性

由表1可知，枯草芽孢桿菌HJD.A32 在不同的抗生素中表現(xiàn)不同的敏感性。當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)β-內(nèi)酰胺類中的阿莫西林和氨芐青霉素、四環(huán)素類中四環(huán)素、酰胺醇類中氯霉素和甲砜霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基咪唑類和磺胺類表現(xiàn)出極敏感；對(duì)酰胺醇類中氟苯尼考表現(xiàn)出高敏感；對(duì)β-內(nèi)酰胺類中青霉素、氨基糖苷類表現(xiàn)出中度敏感；對(duì)喹諾酮類中氧氟沙星表現(xiàn)為不敏感。當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度為10-1mg/mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)喹諾酮類中氧氟沙星、硝基咪唑類中甲硝唑表現(xiàn)出極敏感；對(duì)β-內(nèi)酰胺類中阿莫西林和氨芐青霉素、四環(huán)素類中四環(huán)素、酰胺醇類中氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類中紅霉素表現(xiàn)出高敏感；對(duì)氨基糖苷類中鏈霉素、氨基糖苷類中慶大霉素和新霉素、四環(huán)素類中土霉素、酰胺醇類中甲砜霉素表現(xiàn)出中度敏感；對(duì)β-內(nèi)酰胺類中青霉素、酰胺醇類中氟苯尼考、硝基咪唑類中替硝唑和磺胺類表現(xiàn)出低敏感。當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度為10-2mg/mL 時(shí)，對(duì)β-內(nèi)酰胺類中阿莫西林和氨芐青霉素、四環(huán)素類中四環(huán)素、酰胺醇類中氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類中紅霉素、硝基咪唑類中甲硝唑表現(xiàn)出中度敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類中青霉素、氨基糖苷類中鏈霉素、四環(huán)素類中土霉素、酰胺醇類中甲砜霉素、喹諾酮類中氧氟沙星、硝基咪唑類中替硝唑表現(xiàn)出低敏感。當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度為10-3mg/mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類中氧氟沙星、硝基咪唑類中替硝唑表現(xiàn)出低敏感。當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度為10-4mg/mL和10-5mg/mL 時(shí)，硝基咪唑類中替硝唑表現(xiàn)出低敏感?？傊?，枯草芽孢桿菌HJD.A32 除對(duì)喹諾酮類中的諾氟沙星不敏感外，對(duì)其它抗生素都敏感。隨著抗生素濃度的升高，表現(xiàn)為很敏感，表明該菌體不具有耐藥性，作為益生微生態(tài)制劑可以放心使用。

3 結(jié)論

1）枯草芽孢桿菌HJD.A32 具有良好的產(chǎn)酶性能，在麩皮固態(tài)培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h，液化酶、糖化酶和蛋白酶活力達(dá)4.43，1 874.23 U/g 和181.91 U/g，具有促進(jìn)胃、腸道蛋白類物質(zhì)及淀粉類物質(zhì)消化的功能。

2）枯草芽孢桿菌HJD.A32 生長(zhǎng)曲線的變化趨勢(shì)在30～50 ℃之間保持生長(zhǎng)，而生長(zhǎng)繁殖速度隨著溫度的升高逐漸降低。當(dāng)溫度在55 ℃以上時(shí)，生長(zhǎng)繁殖可受到抑制。

3）枯草芽孢桿菌HJD.A32 對(duì)氯化鈉和膽鹽有一定的耐受性，最高耐氯化鈉、膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%，1%；對(duì)表面活性劑或乳化劑（SDS、LAS、AES、吐溫20、吐溫80）具有一定的耐受性；具有高溫耐受性，經(jīng)高溫100 ℃處理5 min 仍可以生長(zhǎng)繁殖；對(duì)模擬人工胃液和腸液有一定的耐受性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，該菌可以適應(yīng)這種環(huán)境并生長(zhǎng)繁殖；枯草芽孢桿菌HJD.A32 除對(duì)喹諾酮類中的諾氟沙星不敏感外，對(duì)其它多種抗生素都敏感。以上研究為產(chǎn)細(xì)菌素枯草芽孢桿菌HJD.A32 微生態(tài)制劑的開發(fā)奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

性感----------------+-敏-5 10 /mm圈菌抑 性感敏0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-2.01±0.19+0.00±0.00-。＞20 mm圈菌，抑性感敏的素生抗 對(duì)HJD.A32菌桿孢芽草枯 1表Sensitivityof B.subtiilis HJD.A32 to antibiotics Table 1 -1·mL /mg度濃量質(zhì)素生抗-4 10-3 10-2 10-1 10 1 /mm圈菌抑 性感敏 /mm圈菌抑 性感敏 /mm圈菌抑 性感敏 /mm圈菌抑 性感敏 /mm圈菌抑0.00±0.00-0.00±0.00++11.18±0.24+++19.18±0.10++++ 23.10±0.16 林西0.00±0.00-0.00±0.00+2.03±0.10+5.02±0.11++12.20±0.23素0.00±0.00-0.00±0.00++10.07±0.13+++15.01±0.22++++ 20.19±0.15 素霉青0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00+9.19±0.09++13.01±0.11素霉0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00+4.24±0.18++11.03±0.17素0.00±0.00-0.00±0.00+9.34±0.21++10.21±0.11++12.04±0.13素0.00±0.00+5.01±0.14++11.18±0.12+++16.19±0.17++++ 21.06±0.10 素0.00±0.00+2.19±0.34+6.34±0.23++13.31±0.31+++18.14±0.2素0.00±0.00-0.00±0.00++13.19±0.2+++17.04±0.24++++ 26.16±0.19 素0.00±0.00-0.00±0.00+5.17±0.16++13.16±0.32++++ 20.14±0.30 素霉0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00+9.07±0.20+++18.18±0.16考尼0.00±0.00-0.00±0.00++11.31±0.24+++15.20±0.18++++ 25.13±0.14 素0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00++++22.31±0.21 素霉0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00星沙0.00±0.00+2.06±0.14+9.01±0.31++++20.19±0.18 ++++ 22.03±0.23 星沙0.00±0.00-0.00±0.00++12.34±0.21++++ 20.14±0.15 ++++ 24.07±0.24 唑3.15±0.24+4.51±0.26+5.15±0.15+6.18±0.21++++20.16±0.24 唑0.00±0.00-0.00±0.00-0.00±0.00+4.57±0.15++++21.17±0.34 感敏極示”表；“++++圈＜20 mm菌，抑感敏高示”表；“+++＜15 mm圈菌，抑感敏中示”表；“++＜10 mm圈菌，抑感敏低示”表；“+圈＜0 mm菌素生抗莫阿類胺酰內(nèi)β-霉青芐氨大慶類苷糖基氨霉新霉鏈環(huán)四類素環(huán)四霉土霉氯類醇胺酰砜甲苯氟霉紅類酯內(nèi)環(huán)大奇阿氟諾類酮諾喹氟氧硝甲類唑咪基硝硝替胺磺類胺磺，抑感敏不示”表：“-注