基于GC-MS-O香氣成分分析和多元統(tǒng)計分析的柚子品種鑒別

高 歌 龐雪莉 劉海華 鄒 輝 廖小軍*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點實驗室國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083 2 北京物資學(xué)院 北京市物流系統(tǒng)與技術(shù)重點實驗室 北京101149 3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 山東青島266001）

柑橘類飲料以其優(yōu)美的色澤、豐富的營養(yǎng)、芳香的口味吸引著廣大消費者，在全球廣受推崇，購買量也是最大的。在整個果汁市場中，2/3 都是這類產(chǎn)品，按照原料的區(qū)別，一般又可以細(xì)分成：橙汁、柚汁、柑汁等多種類型[1]。我國種植柚子樹歷史悠久，產(chǎn)地分散，品種繁多，開展柚子品種鑒別研究具有重要的意義。柚子汁是一個復(fù)雜體系，其組成既包括揮發(fā)性化合物（如醇類、醛類、酮類、酯類等），也包括非揮發(fā)性化合物（如有機酸和糖等）[2]。這些揮發(fā)性化合物雖然只有痕量級別的含量，但是它們的存在構(gòu)成了必不可少的特征香氣[3-4]。香氣是影響食品特性的重要因素，與食欲、營養(yǎng)密切相關(guān)。不同品種的水果的香氣成分不同，香氣成分能夠客觀地反映不同水果品種的風(fēng)味特點，是評價果實風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)[5]。

目前，研究揮發(fā)性物質(zhì)的技術(shù)主要以氣相色譜質(zhì)譜連用（GC-MS）、電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）、三重四級桿質(zhì)譜（LC-QQQ-MS/MS）等為代表的質(zhì)譜技術(shù)，高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、薄層色譜（TLC）等為代表的色譜技術(shù)，以及傅里葉紅外光譜（FT-IR）、二維紅外光譜（2D）、紫外分光光譜（UV）等為代表的光譜技術(shù)[6]。作為一種成熟的檢測方法，GC-MS 以其樣品量小、檢測限低、靈敏度高的優(yōu)點廣泛應(yīng)用于蜂蜜、茶葉、水果、酒類等揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定[7]。PCA 是一種通過數(shù)據(jù)壓縮對多維數(shù)據(jù)進行降維的多元統(tǒng)計分析方法，它的優(yōu)勢在于操作簡單，沒有參數(shù)限制，應(yīng)用范圍較廣，常被用于人臉識別、圖像壓縮、特征提取等領(lǐng)域[8]。PLS-DA 是在PCA 的基礎(chǔ)上，多因變量對多自變量的回歸建模方法，在產(chǎn)品質(zhì)量預(yù)報、毒物分析、食品分析、環(huán)境化學(xué)等方面有著廣泛的應(yīng)用[9]。目前，結(jié)合GC-MS 分析和多元統(tǒng)計分析對我國柚子品種品質(zhì)，特別是揮發(fā)性物質(zhì)特性的研究尚為空白。本文利用GC-MS-O 結(jié)合PCA 和PLS-DA 多元統(tǒng)計方法對我國5 個柚子品種的揮發(fā)性成分和香氣貢獻(xiàn)組分進行分析，研究其成分、品種、味道間的相互關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

柚子原料：采摘區(qū)間是2015年11月份至2016年1月份。5 個品種分別為處紅柚（浙江麗水）、胡柚（浙江常山）、強德勒（江西贛州）、西柚（江西贛州）和黃金柚（福建平和）。

化學(xué)試劑：高純氦氣、正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C8-C20）。

1.2 儀器

SPME 手動進樣器（DVB/CAR/PDMS 萃取頭），美國Supelco 公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C 型），美國安捷倫公司；DB-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），美國安捷倫公司；pH 計（STARTER 2100/3C 型），美國奧豪斯公司；阿貝折射儀（AR2008 型），德國Kruess 公司；自動電位滴定儀（842 型），瑞士萬通公司；色差儀（Color Quest），美國Hunterlab 公司；高效液相色譜儀（LC-20A 型），日本島津公司；糖柱（Asahipak NH2P-50 4E），美國Water 公司；紫外分光光度計（UV-762），上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 對采摘后的新鮮柚子進行榨汁，倒入60 mL EVOH 瓶中，通過液氮進行冷凍處理，-80 ℃儲藏。

1.3.2 理化指標(biāo)分析 25 ℃室溫下，用pH 值為6.86 和4.01 的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液對pH 計進行較正，測定樣品的pH 值?？扇苄怨绦挝锏臏y定用數(shù)字阿貝折光儀，測前儀器先用蒸餾水調(diào)零，測定時將2滴樣品滴于棱鏡上，選擇溫度校正模式測定（25℃）。糖酸比為總可溶固形物與總酸的比值。

1）色澤的測定 對全自動色差儀用光阱和白板調(diào)零后，取20 mL 搖勻的柚子汁置于比色杯中，在反射模式下測定L、a、b 值。L 為明度指數(shù)，反映樣品的亮度，±a 反映樣品的紅值和綠值，±b反映樣品的黃值和藍(lán)值，ΔE 為兩點之間的變化值[10]。

2）總酸的測定 采用電位滴定法測定。量筒量取40 mL 柚子汁于150 mL 小燒杯中，用自動電位滴定儀，0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至終點pH 8.1?？傻味ㄋ岚垂? 計算。

式中：TA——可滴定酸含量；V0——柚子汁樣品總體積；V2——消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)液體積；C——NaOH 標(biāo)準(zhǔn)液的濃度；m——樣品質(zhì)量；V1——滴定所用樣品體積；K——折算系數(shù)，以檸檬酸計，0.070。

3）總酚的測定 采用 Folin-ciocalteu 法測定，參考Singleton 等[11]的方法并略作修改。樣品用超純水按體積比1∶1 稀釋5 倍。Folin-ciocalteu 試劑用超純水按體積比1∶9 稀釋10 倍。取稀釋后的柚子汁0.5 mL，取0.5 mL 稀釋后的柚子汁與2 mL 稀釋的Folin-ciocalteu 試劑混合，加入1.8 mL 7.5% Na2CO3溶液，靜置1 h，用紫外分光光度計測定波長765 nm 處的吸光值。制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每mL 樣品含有相當(dāng)于mg 沒食子酸來表示總酚含量，單位為mg GAE/mL。

4）糖的測定 采用HPLC 法，將50 mL 柚子汁于50 ℃水浴加熱30 min，12 000 r/min 離心15 min，取上清液過0.45 μm 過濾器，待測。采用Waters-HPLC 系統(tǒng)，Asahipak NH2P-50 4E（規(guī)格4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm）色譜柱，RI-2301 示差檢測器，流動相為50 mg/L EDTA 鈣鹽溶液，等速洗脫，進樣量20 μL，流速0.5 mL/min，溫度90℃。

1.3.3 揮發(fā)性組分的提取 參考Liu 等[12]方法，采用頂空固相微萃取（SPME）方法提取。準(zhǔn)確量取30 mL 柚子汁于60 mL 萃取瓶內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)子，保持40 ℃水浴，平衡10 min 后，將固相微萃取針插進，推出萃取纖維頭吸附萃取30 min。隨后，立刻插入進樣口，于250 ℃解吸附5 min 進行GC-MS 數(shù)據(jù)采集。

1.3.4 GC-MS-O 分析 參考Pang 等[13]方法進行揮發(fā)性成分的檢測。毛細(xì)管柱為DB-5 柱（30 m×250 μm×0.25 μm，美國安捷倫），高純N2為載氣，恒定流速1.0 mL/min，分流比1∶50。柱升溫程序：起始溫度40 ℃，維持3 min，以2 ℃/min 速度將其提高至140 ℃，維持2 min，以20 ℃/min 速度將其提高至250 ℃，保持6 min。質(zhì)譜條件：通過全掃描模式開展相應(yīng)的信號采集工作，轟擊能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍39～450 amu，掃描頻率1/s。采用Cheng 等[14]方法檢測香氣活性成分，用嗅辨儀完成這一步，樣品準(zhǔn)備、GC 條件與GC-MS 相同，其中，傳輸線的溫度保持在240 ℃。分析其末端的香氣組分并鑒定。這期間，評價人員登記全部香氣物質(zhì)存在的時間點，同時對具體屬性做出分析，每個樣品評價2 次。最后以每一種物質(zhì)被嗅聞到的總數(shù)即檢測頻率（DF）來表征每種物質(zhì)香氣貢獻(xiàn)大小。將DF 大于或等于2 的物質(zhì)定義為柚子汁的特征香氣成分。

1.3.5 定性、定量分析 利用檢索NIST11 標(biāo)準(zhǔn)譜庫，參照參考文獻(xiàn)[13]中線性保留指數(shù)以及香氣屬性對揮發(fā)性化合物進行定性研究。各種化學(xué)組分用峰面積歸一化法進行定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用軟件SPSS 17.0 進行單因素方差分析，P＜0.05（n=3）。利用軟件SIMCA進行PCA 和PLS-DA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)

果汁的香氣特征，不僅受揮發(fā)性成分的影響，也受非揮發(fā)性成分的組成和含量的影響[15]。表1列出5 個柚子品種的主要理化性質(zhì)，其中，處紅柚和強德勒柚果肉呈紅色，其它3 個品種果肉呈現(xiàn)不同的黃色，這與L*，a*，b*值（見表1）的一致。柚子品種間的總酸、pH、糖酸比以及顏色差異較大，其中，強德勒柚總酸含量最低（0.48）、pH 值（4.61）最高，而處紅柚總酸含量最高（0.82）、pH 值最低（3.73）。強德勒柚糖酸比（18.18）最高，其次是黃金柚（14.3）、胡柚（9.65）、西柚（9.33）和處紅柚（7.74）。處紅柚總酚含量最高（19.52 mg GAE/100 g FW），其次是強德勒柚（18.5 mg GAE/100 g FW）、再其次是胡柚（17.18 mg GAE/100 g FW），而黃金柚（15.78 mg GAE/100 g FW）和西柚（15.58 mg GAE/100 g FW）最低?？梢?，5 個品種柚子的可溶性固形物、總糖及單糖含量之間差異不顯著。

表1 我國柚子品種的產(chǎn)地及主要理化指標(biāo)Table1 The origins and physiochemical properties of different pomelo varieties from China

2.2 揮發(fā)性成分構(gòu)成

5 種柚子樣品中，測定的揮發(fā)性成分總和通過圖1分析，這些種類的揮發(fā)性成分非常多，如：萜烯類、醇類、酚類、酮類、酯類等。經(jīng)定量分析，具有揮發(fā)性的主要成分是萜烯類物質(zhì)，其峰面積百分比是：處紅柚82.54%、西柚78.58%、強德勒柚60.58%、胡柚10.28%、黃金柚9.33%。其次，醇類也較多，其中，黃金柚（33.68%）、胡柚（32.02%）中醇類含量更加突出，西柚（4.67%）、處柚（4.39%）中醇類含量較少，而強德勒柚中未檢出醇類。醛類、酯類、酮類也存在于各種的柚子中。

5 種柚子樣品中鑒定出所有揮發(fā)性物質(zhì)，按照類別和保留時間的先、后順序列于表2。5 個品種的柚子，有香氣貢獻(xiàn)的成分57 種，其中，處紅柚含32 種，胡柚含23 種，強德勒柚含24 種，西柚含32 種，黃金柚含24 種。檸檬烯、大根香葉烯、γ-摩勒烯、壬醛和癸醛為5 種柚子的共有組分，其含量有差異。檜烯、紫蘇烯、α-愈創(chuàng)木烯、（Z）-檸檬醛、（E）-芳樟醇僅在處紅柚中發(fā)現(xiàn)，（E）-2-庚烯醛、3-辛酮僅存在于胡柚中，β-欖香烯和對乙烯基愈瘡木酚僅存在于強德勒柚中，γ-芹子烯和枯醇僅存在于西柚中，α-紫羅酮、（E）-香葉基丙酮、β-紫羅酮僅存在于黃金柚中。檸檬烯是強德勒柚、西柚、胡柚和處紅柚中較突出的香氣成分，其相對峰面積分別占33.47%（強德勒柚）、21.64%（西柚）、9.7%（胡柚）和7.9%（處紅柚）。黃金柚中突出的香氣成分是己醇和己醛，相對峰面積百分比占28.48%和5.82%。

2.3 特征香氣組分分析

揮發(fā)性成分含量的高低并不代表實際感官閾值的高低，通過GC/MS-O 嗅聞頻率檢測辨識揮發(fā)性成分。據(jù)表3所示，通過嗅覺感受的柚子香氣活性成分38 種，其香氣屬性有：香脂味、松香味、柑橘味、木香味、青草味、花香、薄荷味。

圖1 不同柚子品種中揮發(fā)性成分含量（%）Fig.1 The relative content（%）of volatile components in different pomelo varieties

這些品種的柚子里都存在香脂味物質(zhì)，這是人們經(jīng)?？梢月劦降闹匾兜纴碓础τ阼肿?，松香味同樣是其較突出的香氣屬性，在強德勒柚和西柚里，β-蒎烯的作用比較突出，是松香味的重要來源，而萜品油烯是處紅柚、胡柚和西柚中貢獻(xiàn)該屬性的重要物質(zhì)。柚子里最重要的香氣屬性就是人們聞到的柑橘味，它是來自檸檬烯、壬醛、癸醛。其它貢獻(xiàn)柑橘味有β-蓽澄茄油萜，存在于很多品種的柚子中，而黃金柚沒有這種味道。在處紅柚、西柚、黃金柚中普遍存在諾卡酮。貢獻(xiàn)木香味的重要來源是大根香葉烯，存在于5 個品種的柚子中。在處紅柚、強德勒柚、西柚中普遍存在δ-欖香烯、香橙烯和γ-杜松烯，呈木香味。青草味來自γ-摩勒烯、β-氧化石竹烯、己醛、己醇、1-庚醇、壬醇、（E）-香葉基丙酮。在處柚、強德勒柚、西柚、黃金柚中都有薄荷味，這是因為其中還有β-環(huán)化枸櫞醛。處紅柚中有較清淡的花香，是因為其中存在（E）-芳樟醇，而強德勒柚有丁香味，是因為其中存在乙烯基愈瘡木酚。在黃金柚中有紫羅蘭的味道，是因為其中有β-紫羅酮。

2.4 PCA 分析

這是重要的多元線性分析方法，PCA 是通過數(shù)據(jù)降維的原理，主要研究物質(zhì)及其相應(yīng)的變量情況，與各個品種的潛在關(guān)系[16]。分析表明，這些品種的柚子的揮發(fā)性成分是不同的。PCA 法可以較好地區(qū)分不同的柚子品種。如圖2a 所示，PC1、PC2 和PC3 作為前3 個主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別為40.5%，25.2%和18.6%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到84.4%，能較好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息。

載荷圖主要提供香氣貢獻(xiàn)組分與樣品間的相關(guān)性。如圖2b 所示，處紅柚區(qū)分于其它品種的主要成分為大根香葉烯、β-蓽澄茄油萜、杜松萜烯、γ-摩勒烯等，產(chǎn)生胡柚獨特香氣的主要成分為1-庚醇、3-辛酮、聚傘花素等，強德勒柚香氣特征主要的貢獻(xiàn)物為β-欖香烯、瓦倫烯、苯乙烯和對乙烯基愈瘡木酚等，西柚的主要香氣貢獻(xiàn)物為異丁香烯、α-石竹烯、菖蒲烯、甲基庚烯酮等，而黃金柚和壬醛、癸醛、己醇、辛醇、2-正戊基呋喃這些化合物高度相關(guān)聯(lián)。

c/%量含對相柚金黃柚西柚勒德強nd nd nd 2.4±0.35 0.92±0.07 0.41±0.11 1.33±0.52 0.52±0.04 0.21±0.05 0.9±0.11 0.04±0.01 0.06±0.02 0.54±0.09 nd nd nd nd nd 28.48±3.97 3.36±0.15 nd 2.50±0.04 0.08±0.02 nd 1.46±0.07 nd nd nd nd nd nd 0.06±0.01 nd 0.72±0.08 nd nd nd nd 0.05±0.01 nd nd nd nd 7.58±0.01 1.77±0.54 0.1±0.01 nd nd 0.32±0.01 nd nd 0.71±0.02 nd nd 0.12±0.06 1.29±0.04 nd 0.29±0.07 nd nd 0.34±0.04 nd nd 0.65±0.12 0.72±0.02 5.95±1.92 nd 0.12±0.03 nd 2.78±0.52 nd nd。差準(zhǔn)：標(biāo) c SD。：//www.flavournet.org http站網(wǎng)于源述描味柚胡d柚紅處0.35±0.03 nd 1.94±0.11 0.19±0.01 0.66±0.05 0.16±0.03 nd 0.04±0 nd nd nd 0.05±0.01 15.25±2.12 3.33±0.71 14.79±0.85 nd 1.27±0.66 nd nd 0.23±0.01 nd nd 0.38±0.03 nd nd nd 1.55±0.08 nd nd 3.51±0.51 nd nd nd nd nd nd nd 0.31±0.08 nd 0.02±0 nd 0.44±0.09 nd nd 0.89±0.04 nd 2.09±0.1 nd，氣氣香有中庫：譜；AD數(shù)指留保的較比獻(xiàn)文稱名質(zhì)物法方定鑒b數(shù)指留保醛烯庚）-2-（E，AD，RI MS 951醛壬MS，RI，AD 1 105醛癸，AD，RI MS 1 210醛櫞枸化β-環(huán)MS，RI，AD 1 224醛糠基甲羥5-，AD，RI MS 1 236醛檬（Z）-檸MS，RI，AD 1 276醇己MS，RI，AD 871醇庚1-，AD，RI MS 965醇辛MS，RI，AD 1 069醇樟芳）-（E，AD，RI MS 1 071醇枯MS，RI，AD 1 101醇壬，AD，RI MS 1 175酚木瘡愈基烯乙對，AD，RI MS 1 317酮辛3-，AD，RI MS 981酮烯庚基甲MS，RI，AD 983酮羅紫α-，AD，RI MS 1 423酮丙基葉（E）-香MS，RI，AD 1 446酮羅紫β-，AD，RI MS 1 468酮卡諾MS，RI，AD 1 543酯乙酸己MS，RI，AD 997酯乙酸辛，AD，RI MS 1 203烯乙苯，AD，RI MS 890素花傘聚MS，RI，AD 1 019喃呋基戊2-正MS，RI，AD 986：與；RI較比譜質(zhì)行進 庫Wiley 和NIST用，使：MS法方定 b 鑒。a號）2表（續(xù)號編類種B3 29 B4 30 B5 31 B6 32 B7 33 B8 34 C1類 35醇C2 36 C3 37 C4 38 C5 39 C6 40 D1類 41酚E1類 42酮E2 43 E3 44 E4 45 E5 46 E6 47 F1類 48酯F2 49烴香芳G1 50 G2 51 H1它 52其編別類分成性發(fā)a 揮：注。出檢：未d nd

表3 不同柚子品種中香氣貢獻(xiàn)組分的嗅聞頻率檢測分析Table3 The detection frequency of aroma-active components in different pomelo varietes

圖2 PCA 得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.2 The score figure（a）and loading figure（b）of PCA

2.5 PLS-DA 分析

柚子香氣特征是不同香氣屬性的全面展示，柑橘味、花香味等各種香氣屬性都有過報道[17]。要想獲知國內(nèi)各種類型的柚子品種的香氣特征差異，通過PLS-DA 可以進行各品種柚子與相應(yīng)的香氣屬性的關(guān)聯(lián)研究[18]，圖3是5 個品種與香氣屬性的PLS-DA 雙標(biāo)圖。由此看到，不同品種的柚子的香氣也有比較大的區(qū)別。在圖4中，利用最小二乘判別研究獲得了相應(yīng)的VIP 值，當(dāng)該數(shù)值超過1 的情況下，將它看作能夠分辨各品種柚子的香氣屬性。作者發(fā)現(xiàn)可以區(qū)分5 種柚子的味道，分別是：青草味、花香味、薄荷味、松香味。本結(jié)果為相應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)及感官特性的研究提供重要線索。

3 結(jié)論

圖3 PLS-DA 雙標(biāo)圖Fig.3 The biplot figure of PLS-DA

圖4 不同香氣屬性的VIP 值圖Fig.4 The VIP value of different aroma properties

本研究對我國不同地理來源的5 種柚子的揮發(fā)性成分進行評價和表征，GC-MS 數(shù)據(jù)顯示柚子中揮發(fā)性組分種類構(gòu)成豐富，5 個品種柚子之間揮發(fā)性物質(zhì)和含量均有差異，主要包括萜烯類、醛類、醇類、酮類、酯類等。嗅聞結(jié)果是得到不同柚子品種的主要香氣貢獻(xiàn)組分，呈現(xiàn)柑橘味、松香味、香脂味、青草味、木香味等主要香氣屬性。PCA 分析能很好地區(qū)分不同來源柚子品種，并鑒定出其特征指紋組分；而PLS-DA 分析表明青草味、花香味、薄荷味和松香味作為區(qū)分不同品種柚子的主要特征風(fēng)味。研究表明，基于揮發(fā)性成分差異的GC-MS-O 分析結(jié)合多元統(tǒng)計分析識別不同柚子品種是可行的。本研究對我國5 種柚子的風(fēng)味特征進行研究，為其品質(zhì)控制和鑒定提供理論依據(jù)。