葡萄膜黑色素瘤的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)類型與預(yù)后分析

林敏，吳文捷

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州)

0 引言

葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma，UM)是一種起源于眼睛脈絡(luò)叢中的黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，易向肝臟轉(zhuǎn)移[1]。與其他惡性腫瘤類似，在UM 中，分子機(jī)制不明，死亡率高和治療困難等問(wèn)題依然是困擾臨床醫(yī)生的難題。目前，UM 的治療主要以手術(shù)為主，而由于缺乏良好的預(yù)后診斷生物標(biāo)志物，使得UM 的治療效果非常有限[2]。相關(guān)研究表明[3,4]：淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD3+ T 細(xì)胞等與UM 患者的預(yù)后明顯相關(guān)。然而目前，關(guān)于UM 中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的分子機(jī)制尚不清楚，因此很難評(píng)估免疫細(xì)胞對(duì)于腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所發(fā)揮的作用。CIBERSORT 是一種從復(fù)雜的基因表達(dá)譜中描述其細(xì)胞組成的方法[5]，我們使用該方法能夠分析得到UM 中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，并使用TIMER 分析了免疫細(xì)胞與預(yù)后的關(guān)系，還使用TIMER 分析了UM 中突變率最高的基因和體細(xì)胞突變與免疫細(xì)胞的相關(guān)性。該研究不僅為進(jìn)一步研究UM 的分子機(jī)制提供了新的思路，而且為UM 提供了可供參考的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

GEO(Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[6]是一個(gè)國(guó)際公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)，收集了大量的疾病功能基因組數(shù)據(jù)集。我們用R 語(yǔ)言GEOquery 包[7]從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載并分析樣本來(lái)源可靠的UM 表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE27831和GSE22138，兩數(shù)據(jù)集物種來(lái)源均為人類，平臺(tái)均基于GPL570([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。其中GSE27831 數(shù)據(jù)集包括轉(zhuǎn)移性黑色素葡萄膜瘤組織樣本11 例和非轉(zhuǎn)移性黑色素葡萄膜瘤組織樣本18 例，而GSE22138 數(shù)據(jù)集則包括35 例轉(zhuǎn)移性黑色素葡萄膜瘤組織樣本和28 例非轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤樣本。

1.2 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的評(píng)估

CIBERSORT(https：//cibersort.stanford.edu/) 是一個(gè)利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)計(jì)算免疫細(xì)胞類型和豐度的在線工具。我們使用R 語(yǔ)言中affy 包[8]對(duì)數(shù)據(jù)集GSE27831 和GSE22138 中的CEL 文件通過(guò)RMA 算法進(jìn)行背景校正、數(shù)據(jù)歸一化處理，并使用sva 軟件包[13]去除批次效應(yīng)。應(yīng)用GPL570 平臺(tái)注釋信息在Bioconductor(http：//www.bioconductor.org/) 對(duì)探針矩陣進(jìn)行注釋。最后我們將準(zhǔn)備好的基因表達(dá)矩陣上傳到CIBERSORT，得到免疫細(xì)胞浸潤(rùn)矩陣，篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05。

1.3 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的可視化及評(píng)價(jià)

圖1 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)矩陣二維PCA 聚類圖和免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖

主成分聚類分析(Principal component analysis，PCA)[9]是多維度數(shù)據(jù)降維常用的方法，其主要是通過(guò)獲取數(shù)據(jù)的主要投影方向來(lái)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)向主要特征方向上的映射，從而達(dá)到數(shù)據(jù)降維的效果。我們使用R 語(yǔ)言對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)矩陣進(jìn)行PCA 聚類，并繪制二維PCA 聚類圖展示兩組之間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異。R 語(yǔ)言corrplot 包繪制相關(guān)熱圖以展示22 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性；ggplot2 包[10]繪制小提琴圖用于展示22 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異；igraph 包[11]繪制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖以展示22 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的互作情況，以P＜0.05、｜相關(guān)系數(shù)｜＞0.15 為互作標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)分析

TIMER(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/) 是一個(gè)用于系統(tǒng)分析各種癌癥類型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的在線工具，其可通過(guò)動(dòng)態(tài)顯示圖展示多種腫瘤的免疫學(xué)、臨床和基因組特征[12]。使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)能夠?qū)Ψ治龅玫降腢M 的免疫浸潤(rùn)結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證。我們使用TIMER 對(duì)免疫細(xì)胞與UM 患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了檢測(cè)。目前，人們普遍認(rèn)為基因突變和遺傳是腫瘤形成的關(guān)鍵因素，因此我們使用TIMER 對(duì)UM 中突變率最高的3 個(gè)基因(GNAQ、GNA11 和BAP1) 和2 個(gè)免疫治療熱點(diǎn)基因(CD274 和CD279) 的拷貝數(shù)變異與免疫細(xì)胞的相關(guān)性進(jìn)行了分析。

2 結(jié)果

2.1 葡萄膜黑色素瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析結(jié)果

我們使用CIBERSORT 分析得到UM 中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的矩陣。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的PCA 分析結(jié)果表明(圖1A)：兩樣本能夠明顯分開(kāi)，表明兩組中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的情況具有明顯的差異。免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖表明(圖1B)：漿細(xì)胞與輔助T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞和單核細(xì)胞呈正相關(guān)，而漿細(xì)胞與gamma T 細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；CD8+ T 細(xì)胞和輔助T 細(xì)胞、gamma delta T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞呈明顯正相關(guān)，而CD8+ T 細(xì)胞與M0 巨噬細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)；CD4+ 記憶T 細(xì)胞與輔助T細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)；輔助T 細(xì)胞與NK 細(xì)胞和靜息樹(shù)突狀細(xì)胞呈明顯正相關(guān)，而輔助T 細(xì)胞與M0 巨噬細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)；輔助T 細(xì)胞與單核細(xì)胞呈明顯正相關(guān)，而輔助T 細(xì)胞與gamma T 細(xì)胞和M1 巨噬細(xì)胞呈明顯正相關(guān)；gamma T 細(xì)胞與M1巨噬細(xì)胞呈明顯正相關(guān)，而gamma T 細(xì)胞與M2 巨噬細(xì)胞和靜息樹(shù)突狀細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)；NK 細(xì)胞與M0 巨噬細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)；M0 巨噬細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞呈明顯正相關(guān)；M1 巨噬細(xì)胞與活動(dòng)肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈明顯正相關(guān)，而M1 巨噬細(xì)胞與靜息樹(shù)突狀細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)；靜息樹(shù)突狀細(xì)胞與中性粒細(xì)胞呈明顯正相關(guān)。

2.2 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的豐度與相互作用結(jié)果

使用小提琴圖對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的豐度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明(圖2A)：漿細(xì)胞、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、靜息樹(shù)突狀細(xì)胞和活動(dòng)樹(shù)突狀細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤中浸潤(rùn)較多，而CD4+ T 細(xì)胞、CD4+ 記憶T 細(xì)胞、輔助T 細(xì)胞、gamma T 細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤中浸潤(rùn)較少。通過(guò)疫細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖2B)結(jié)果表明M1 巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞和CD8+ T 細(xì)胞與其他細(xì)胞關(guān)系最為密切。

2.3 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與患者預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)TIMER 分析B 淋巴細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞、CD4+ T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明( 圖3)：CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)較多提示患者預(yù)后較差(Log-rank P=0.001)，而中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較多提示患者預(yù)后良好(Log-rank P=0.005)。

2.4 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)分析

我們通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到在UM 中突變率最高的基因?yàn)锽AP1、GNA11 和GNAQ。3 個(gè)基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性分析結(jié)果表明(圖4)：BAP1 突變與CD8+ T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞密切相關(guān)。我們通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)探索UM 中CD274 和CD279 與6 種免疫細(xì)胞相關(guān)性的結(jié)果表明(圖5)：CD274 與CD4+ T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞相關(guān)，而CD279 與CD8+ T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相關(guān)。

3 討論

UM 成人眼內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，易與多種眼內(nèi)疾病混淆。早在1980 年，Sunba 等早已表明免疫反應(yīng)與腫瘤的組織學(xué)特征存在明顯的相關(guān)性[13]。之后隨著人們對(duì)于UM 發(fā)病過(guò)程中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)機(jī)制的研究，免疫指標(biāo)早已經(jīng)用于UM 診斷和預(yù)后的評(píng)估，針對(duì)免疫逃逸機(jī)制的免疫療法也逐漸進(jìn)入人們的視野[14,15]。在揭開(kāi)UM中免疫浸潤(rùn)機(jī)制的過(guò)程中，多種免疫細(xì)胞在UM 中的作用逐漸被揭露。Gartrell 等研究表明[16]，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在原發(fā)性UM 中發(fā)揮著重要的作用。Falleni 等研究表明[17]，M1 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)型為M2巨噬細(xì)胞有利于UM 的侵襲和轉(zhuǎn)移。這些免疫細(xì)胞不但在UM的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，而且與患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)[18]。目前，由于人們對(duì)于UM 發(fā)展過(guò)程中免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然處于探索階段，因此UM 的免疫治療一直很難取得突破性的進(jìn)展。所以我們利用CIBERSORT 這項(xiàng)新的技術(shù)，通過(guò)對(duì)UM 的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而得到UM 侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，并分析了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與患者預(yù)后的關(guān)系，也分析了UM中高突變基因和體細(xì)胞突變基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。

我們使用CIBERSORT 對(duì)數(shù)據(jù)集GSE27831 和GSE22138 中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積算法，結(jié)果表明漿細(xì)胞、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、靜息樹(shù)突狀細(xì)胞和活動(dòng)樹(shù)突狀細(xì)胞、CD4+ T 細(xì)胞、CD8+ 記憶T 細(xì)胞、輔助T 細(xì)胞、gamma T 細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)在兩組中存在明顯差異。Bronkhorst 等[19]通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)表明CD4+T 細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞在UM 中存在浸潤(rùn)的情況。Nagarkatti-Gude等通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明[20]：在UM 的腫瘤微環(huán)境中，IL-6 和IP-10 可促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞浸潤(rùn)。NK 細(xì)胞可以直接吞噬和裂解UM 細(xì)胞，因此不但具有控制UM 細(xì)胞增殖的作用，而且可以抑制UM 從眼向肝轉(zhuǎn)移[21-23]。M1-M2 型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在UM 侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[17]，因此M1 性巨噬細(xì)胞在侵襲性UM 中浸潤(rùn)較少，這與我們分析的結(jié)果類似。樹(shù)突狀細(xì)胞在UM 免疫機(jī)制中起著抗原提呈的作用，是激活CD4+ T 細(xì)胞和CD8+ T 細(xì)胞必不可少的一步，UM 細(xì)胞可通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的活性來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的破壞[24,25]。以上的研究與我們預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，這說(shuō)明我們對(duì)于UM 中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的分析具有一定的可信度。因此我們推測(cè)漿細(xì)胞、gamma T 細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等尚未報(bào)道的細(xì)胞可能在UM 的微環(huán)境中也發(fā)揮著重要的作用，有待我們進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖2 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度和相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析6 種免疫細(xì)胞與患者預(yù)后的關(guān)系

圖4 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)中突變率最高的基因與6 中免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析圖。A-C 圖分別為BAP1、GNA11、GNAQ 與6 種免疫細(xì)胞相關(guān)性分析圖，藍(lán)色代表正常組，紅色代表突變組。

圖5 體細(xì)胞突變基因與6 種免疫細(xì)胞相關(guān)性分析圖。

使用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)6 種免疫細(xì)胞與UM 患者的預(yù)后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)較多提示患者預(yù)后較差，而中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較多提示患者預(yù)后良好。CD8+ T 細(xì)胞不僅與腫瘤血管生成有關(guān)，而且可以促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)向M2 型巨噬細(xì)胞，因此與腫瘤的預(yù)后不良明顯相關(guān)[19,26]。關(guān)于CD8+ T 細(xì)胞和UM患者預(yù)后的關(guān)系與我們的分析結(jié)果一致，說(shuō)明我們對(duì)于免疫細(xì)胞與患者預(yù)后關(guān)系的分析準(zhǔn)確可靠。而關(guān)于中性粒細(xì)胞與UM 患者預(yù)后的關(guān)系目前尚未報(bào)道，有待進(jìn)一步的研究。

通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)突變率最高的基因與6 種免疫細(xì)胞關(guān)系的結(jié)果顯示：BAP1 與CD8+ T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞關(guān)系密切；CD274 和CD279 與6 中免疫細(xì)胞結(jié)果顯示：CD274 與CD4+ T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞關(guān)系密切，CD279 與CD8+ T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞關(guān)系密切。Gezgin 等研究表明[27]，BAP1 的低表達(dá)可以促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞的增殖。而我們發(fā)現(xiàn)的其他幾個(gè)調(diào)控關(guān)系，目前尚未報(bào)道，這有可能幫助我們發(fā)現(xiàn)侵襲性UM 腫瘤微環(huán)境中新的調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，我們對(duì)侵襲性UM 基因芯片進(jìn)行分析，得到了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的豐度、患者預(yù)后和基因突變的關(guān)系?？赡転槲覀兲剿髑忠u性UM 的分子免疫機(jī)制提供指導(dǎo)，也有助于我們開(kāi)發(fā)侵襲性UM 新的治療方法。