孕婦外周血分離胎兒有核紅細(xì)胞與FISH分析技術(shù)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用分析

王 偉，張 紅，袁瓊英

（1.黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 黃岡 438002；2.黃岡市婦幼保健院，湖北 黃岡 438000）

想要成功由孕婦外周血內(nèi)分選胎兒有核紅細(xì)胞，幾乎無可避免發(fā)生母體細(xì)胞受污染問題，所以需要對此準(zhǔn)確鑒定。臨床中目前應(yīng)用于胎源性有核紅細(xì)胞鑒定主要包括以下幾種方法[1]：形態(tài)學(xué)染色、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))對SRY基因擴(kuò)增、STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）的擴(kuò)增、FISH（熒光原位雜交）等。所以在臨床中通過運(yùn)用胎兒有核細(xì)胞等特點(diǎn)，實現(xiàn)無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷意義重大且十分可行。在孕婦外周血中富集、純化胎兒有核紅細(xì)胞，作為非侵入性操作，且運(yùn)用于臨床有著安全可靠無損傷母嬰的技術(shù)特點(diǎn)[2]。因此本研究探討分析孕婦外周血分離胎兒有核紅細(xì)胞與 FISH分析技術(shù)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于2018年1月至2019年1月期間，我院收治的20例11～24周妊娠高危孕婦展開研究。所有產(chǎn)婦孕周均為 11～24周，年齡均為 21～37歲，平均年齡為（28.7±3.5）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有產(chǎn)婦均未存在嚴(yán)重貧血情況，陽性對照其中有4例足月分娩時臍帶血，陰性對照均屬于并未存在孕產(chǎn)史的健康女性。（2）對本次研究知情同意配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)；（1）嚴(yán)重心、肝、腎系統(tǒng)疾病者；（2）合并糖尿病、妊娠并發(fā)癥以及剖宮產(chǎn)等病癥。

1.2 方法

（1）密度梯度離心。對所有納入本次的孕婦均抽取15ml肘部靜脈血和1ml臍血，以常規(guī)方式進(jìn)行分離并取單個核細(xì)胞。

（2）FACS分選。通過運(yùn)用PBS洗滌分離得出的單個核細(xì)胞重復(fù)2次，之后根據(jù)1×106個細(xì)胞，加入至單克隆抗體CD71-PE（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1）內(nèi) 10ul，完成 0.5h常規(guī)室內(nèi)孵育之后，進(jìn)行PBS（磷酸緩沖鹽溶液）沖洗后將固定、破膜劑加入其中做固定破膜處理，并且根據(jù)以上細(xì)胞比例將HbF-FITC（(HbF)的偶聯(lián)于FITC的單克隆抗體）單克隆抗體加入其中，進(jìn)行20min常溫室內(nèi)孵育后PBS 沖洗，實現(xiàn)上機(jī)分選并同類型對照將非特異性排除，運(yùn)用流式細(xì)胞儀設(shè)備設(shè)定了FSC、SSC和對應(yīng)的熒光強(qiáng)度相關(guān)參數(shù)，最終分選得出CD71、HbF雙陽性細(xì)胞。

（3）FISH 通過將抽取分離所得的細(xì)胞作充分洗滌處理之后，運(yùn)用0.075mol/L低滲30min，甲醇冰乙酸按照3:1比例，固定支座細(xì)胞混懸液滴片備用，并運(yùn)用蛋白酶K硝化液硝化處理滴片3min，運(yùn)用2×SSC進(jìn)行2min洗滌處理，逐次運(yùn)用75%、85%、100%不同濃度乙醇進(jìn)行2min脫水處理，之后將探針13、18、21加入其中，X、Y使用蓋玻片蓋封，在78℃下進(jìn)行3min變性處理，運(yùn)用濕盒進(jìn)行避光37℃過夜待用。將蓋玻片去除之后置入72℃下，運(yùn)用含有0.3%濃度NP40的0.4×SSC、0.1%濃度的NP40的2×SSC，進(jìn)行2min洗脫處理以及40s的DAPI重復(fù)染色，之后封片并于顯微鏡設(shè)備下，對熒光圖像處理系統(tǒng)仔細(xì)觀察分析。分娩后隨訪嬰幼兒。

2 結(jié)果

2.1 單密度梯度離心之后細(xì)胞涂片檢查

對20例孕婦的血樣本進(jìn)行處理檢查，并未發(fā)現(xiàn)NRBCs，NRBCs的體積較大且細(xì)胞核濃染，細(xì)胞漿以紫紅色為主，NRBCs對比母親機(jī)體的有核紅細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果為1：105～107。陽性對照組存在大量NRBCs。

2.2 孕婦外周血中HbF、CD71細(xì)胞含量

20例所有孕婦的外周血標(biāo)本NRBC分選，達(dá)100%的分選率。CD71以及HbF雙陽性細(xì)胞含量情況如下，20例高危孕婦的CD71及HbF雙陽性細(xì)胞含量是（3.46±1.65）×10-2，足月兒臍血為（30.46±21.39）×10-2，健康女性為（0.08±0.06）×10-2，經(jīng)過對其中18例孕婦運(yùn)用FISH分析技術(shù)均成功分析，且并未發(fā)現(xiàn)存在任何異常問題（見表 1）。

表1 孕婦外周血中HbF、CD71細(xì)胞含量

2.3 孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞FISH結(jié)果

在5例分娩男胎的孕婦機(jī)體外周血標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用Y探針信號，3例女胎在母體外周血標(biāo)本內(nèi)，除了X探針信號并未見Y探針信號。但是在后期胎兒的分娩過程中進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)4號標(biāo)本經(jīng)FISH誤診是女胎，實為男胎。運(yùn)用 18、21探針進(jìn)行FISH診斷時，并未發(fā)現(xiàn)探針信號細(xì)胞，且隨訪嬰幼兒分娩結(jié)局也并未發(fā)現(xiàn)先天遺傳疾病。

3 討論

在臨床于1983年便有學(xué)者對孕婦外周血內(nèi)胎兒細(xì)胞分離富集問題展開研究，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)孕婦死于子癇疾病機(jī)體循環(huán)，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的存在，經(jīng)臨床深入研究這一觀點(diǎn)逐漸演變并得以證實[3]。在目前臨床統(tǒng)一劃分了孕婦外周血內(nèi)的胎兒細(xì)胞種類，包括四類分別為滋養(yǎng)層細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞[4]。其中胎兒有核紅細(xì)胞由于本身擁有十分完整的基因組DNA，所以被廣泛運(yùn)用于臨床胎兒遺傳類疾病分析中，并且生存周期較短細(xì)胞數(shù)量較多，不受上次妊娠干擾。不僅如此有核紅細(xì)胞還具備了穩(wěn)定的細(xì)胞表面抗原特性，可以將CD71類膜受體分離，所以目前在臨床被統(tǒng)一證實，可以運(yùn)用于孕婦產(chǎn)前無創(chuàng)傷診斷的關(guān)鍵靶細(xì)胞[5]。

臨床運(yùn)用于胎兒細(xì)胞分離富集有諸多方法，本次研究中通過運(yùn)用流式細(xì)胞分析儀，經(jīng)近年臨床研究結(jié)果統(tǒng)一發(fā)現(xiàn)運(yùn)用 FACS方法，可以作為較普遍的細(xì)胞自動化分選技術(shù)[6]。鞏固運(yùn)用中快速測量體內(nèi)分散懸浮細(xì)胞生物化學(xué)及物理特定參數(shù)，并且以原本設(shè)定的參數(shù)范圍為依據(jù)，劃分測量的細(xì)胞亞群。以往研究中Bianchi表示,FACS是最佳分選富集胎兒細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù)[7]。FACS具備了達(dá)到較高細(xì)胞富集純度的優(yōu)勢特點(diǎn)，并且運(yùn)用該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)胎兒細(xì)胞富集高達(dá)1000倍。本次研究結(jié)果也證實通過20例所有孕婦的外周血標(biāo)本NRBC分選，達(dá)100%的分選率。20例高危孕婦的CD71及HbF雙陽性細(xì)胞含量是（3.46±1.65）×10-2，足月兒臍血為（30.46±21.39）×10-2，健康女性為（0.08±0.06）×10-2。

如今臨床廣泛運(yùn)用的胎兒細(xì)胞分離抗原標(biāo)記主要包括了陽性、陰性兩類選擇。在陽性選擇中又以γ珠蛋白、CD71等選擇為主，在陰性選擇中則主要運(yùn)用CD45轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。該受體作為臨床中胎兒紅細(xì)胞膜抗原組織，可以達(dá)到隨著孕婦的孕周逐漸增加細(xì)胞高表達(dá)也愈明顯的特性，更會隨著胎兒紅細(xì)胞逐漸成熟，此種抗原組織也會逐漸不見，因此對于臨床分離胎兒細(xì)胞尤為適合[8]。γ珠蛋白一般在胎兒血紅蛋白細(xì)胞中存在，在孕婦孕周 6周左右出現(xiàn)γ珠蛋白，盡管妊娠會對孕婦機(jī)體產(chǎn)生刺激作用，合成少量的 HbF，但是胎兒含有的NRBCs含量要明顯高于HbF含量。以往研究中表示γ珠蛋白 83%～100%的細(xì)胞均為NRBCs，可以達(dá)到 45%的細(xì)胞分離純度。本次研究結(jié)果通過以CD71、HbF雙陽性細(xì)胞，進(jìn)行胎兒細(xì)胞標(biāo)記和流式細(xì)胞儀分選，能夠進(jìn)一步提高獲得胎兒有核紅細(xì)胞的FISH分析數(shù)量及純度[9]。

FISH技術(shù)在臨床作為對母血內(nèi)胎兒細(xì)胞重要細(xì)胞遺傳學(xué)方法之一，能夠直接檢測有關(guān)異常染色體的細(xì)胞，在臨床以往研究結(jié)果中表明，運(yùn)用FISH技術(shù)能夠成功實現(xiàn)18三體、21三體胎兒的無創(chuàng)診斷。本次研究結(jié)果也證實在5例分娩男胎的孕婦機(jī)體外周血標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用Y探針信號，3例女胎在母體外周血標(biāo)本內(nèi)，除了X探針信號并未見Y探針信號。但是在后期胎兒的分娩過程中進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)4號標(biāo)本經(jīng)FISH誤診是女胎，實為男胎。運(yùn)用18、21探針進(jìn)行FISH診斷時，并未發(fā)現(xiàn)探針信號細(xì)胞，且隨訪嬰幼兒分娩結(jié)局也并未發(fā)現(xiàn)先天遺傳疾病。