兔流行性腹脹病樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定

胡波 魏后軍 范志宇

摘要：從發(fā)生典型病理特征的兔流行性腹脹病死亡兔盲腸內(nèi)容物中分離到1株產(chǎn)氣莢膜梭菌，命名為SD14-02。經(jīng)革蘭氏染色、生化鑒定、16S rRNA比對(duì)和毒素型特異性PCR等方法對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行鑒定和分型，結(jié)果顯示，分離株SD14-02為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，生化鑒定顯示其符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化圖譜。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，SD14-02的16S rRNA基因序列與產(chǎn)氣莢膜梭菌位于同一分支。經(jīng)毒素型特異性PCR方法鑒定，SD14-02為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，蛋白電泳顯示其與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗株蘇84-A存在一定差異。動(dòng)物試驗(yàn)證明SD14-02對(duì)小鼠具有致病性。研究結(jié)果為兔流行性腹脹病致病原的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：兔流行性腹脹病;產(chǎn)氣莢膜梭菌;分離;鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.291? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）06-0160-04

收稿日期：2019-02-14

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：CARS-43-C-1）。

作者簡(jiǎn)介：胡 波（1982—），男，江蘇南京人，博士，副研究員，主要從事畜禽疫病防控與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。E-mail：hubolshg@163.com。

通信作者：王 芳，博士，研究員，主要從事畜禽疫病防控及免疫機(jī)理研究。E-mail：rwangfang@126.com。? 兔流行性腹脹病是一種由特定病原菌引起的兔腸道綜合征，具有一定的傳染性和流行性，但病原未知[1]。中國(guó)于2004年首次發(fā)生該病，且近年來(lái)在我國(guó)江蘇和山東等省份仍有該病的發(fā)生與流行。該病主要發(fā)生于斷奶仔兔至4月齡兔，表現(xiàn)為腹部臌脹、膠凍樣黏液排泄物，病理剖檢可見(jiàn)盲腸內(nèi)容物干硬成塊狀，結(jié)腸內(nèi)存在大量膠凍樣黏液，胃及小腸內(nèi)充滿液體和氣體，發(fā)病兔死亡率最高可達(dá)90%以上[1-2]。該病的臨床癥狀與病理變化與1996—1997年法國(guó)報(bào)道的未知病原的兔流行性腸病[3-4]十分相似，很多學(xué)者認(rèn)為兩者為同一種病[4]。

國(guó)外研究表明，兔流行性腸病為多病原共同作用的結(jié)果，且產(chǎn)氣莢膜梭菌是該腸道綜合征的重要致病原之一[5-6]。腸道菌群分析也表明梭菌屬是病兔盲腸中特異性升高的致病菌群之一[7]。從病兔盲腸樣品中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌具有一定的致病性，通過(guò)口服途徑攻擊斷奶兔后，部分兔表現(xiàn)為盲腸阻塞癥狀，但不能復(fù)制出該病的其他特征，也不能引起死亡。這與常見(jiàn)的導(dǎo)致家兔腸毒血癥的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌在臨床癥狀和病理變化上有明顯差異。本研究采用產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性鑒定培養(yǎng)基成功從兔流行性腹脹病盲腸樣品中分離出1株產(chǎn)氣莢膜梭菌，毒素基因分型結(jié)果顯示為A型，且具有致病性，為該病致病原的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養(yǎng)基

卵黃瓊脂培養(yǎng)基、產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定培養(yǎng)基、多價(jià)蛋白胨-酵母膏（PY）培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物科技有限公司;細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;細(xì)菌DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Pfu高保真酶Mix購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司;凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.3 引物

參照Corby-Harris 等的方法[5]合成細(xì)菌16S rRNA基因通用引物;根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε、ι毒素基因cpa、cpb、etx、iA序列，參照Yoo等的方法[8]合成產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性分型引物。引物均由上海Invitrogen公司合成（表1）。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取含20%甘油凍存的兔流行性腹脹病盲腸內(nèi)

容物1 mL，加入2 mL無(wú)菌水，混勻后500 r/min離心10 min，取200 μL上層液接種于含5%葡萄糖的PY液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜后，劃線于卵黃瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h后，選取具有卵磷脂酶活性的疑似菌落，于產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定培養(yǎng)基平板上進(jìn)一步分離純化。經(jīng)多次純化培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色及鏡檢觀察。

1.5 分離菌株生化試驗(yàn)

利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。將菌株接種于葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、水楊苷、硫化氫、吲哚、硝酸鹽（還原）、明膠等微量生化反應(yīng)管，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.6 分離菌株16s rRNA基因的分析

1.6.1 分離細(xì)菌基因組DNA的提取 采用分離菌株培養(yǎng)物，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌的基因組DNA。

1.6.2 分離菌株16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板，應(yīng)用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：2×PCR Mix 12.5 μL，模板DNA 1.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，加ddH2O至總體積25.0 μL;后執(zhí)行下列反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸5 min，結(jié)束反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，以DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化。

1.6.3 16S rRNA基因的序列分析 將回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行序列測(cè)定，由上海Invitrogen公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中以BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，并從RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中選取相似性較高的代表菌株16S rRNA序列，用MEGA 5.2軟件中Kimura-2參數(shù)矩陣的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7 分離菌株P(guān)CR分型鑒定

由表1可知，產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa、cpb、etx、iA序列特異性引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗株蘇84-A為對(duì)照。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同“1.5.2”節(jié)PCR擴(kuò)增條件。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

1.8 分離菌株的SDS-PAGE分析

取厭氧培養(yǎng)的分離菌株SD14-02和疫苗株蘇84-A，12 000 r/min離心收集菌體，PBS洗滌2次后冰浴超聲破碎，取全菌蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析。

1.9 小鼠致病性試驗(yàn)

將分離菌株培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)后，分別以 1×109 CFU/只和2×109 CFU/只的劑量各腹腔注射6只6周齡ICR小鼠，進(jìn)行ICR小鼠攻毒試驗(yàn)。攻毒后觀察并記錄死亡情況，并對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢和細(xì)菌分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在厭氧條件下，經(jīng)過(guò)卵黃瓊脂培養(yǎng)基和產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定培養(yǎng)基的分離和篩選，從發(fā)生典型兔流行性腹脹病特征的盲腸樣品中分離得到1株產(chǎn)氣莢膜梭菌，命名為SD14-02，革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)兩端鈍圓的革蘭氏陽(yáng)性桿菌（圖1）。

2.2 分離菌株的生化反應(yīng)

對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行了11項(xiàng)生化指標(biāo)的鑒定，結(jié)果顯示，分離菌株符合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化圖譜（表2）。

2.3 分離菌株16S rRNA分析

以SD14-02株提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小在1.5 kb左右的特異性條帶。將回收純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，所得基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank NO. KX986316）。16S rRNA序列在RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，SD14-02與產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）位于同一分支（圖2），表明分離菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.4 分離菌株的基因分型

以產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa、cpb、etx、iA序列特異性引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗株蘇84-A株為對(duì)照，經(jīng)電泳鑒定，產(chǎn)氣莢膜梭菌SD14-02和蘇84-A均擴(kuò)增出大小約為400 bp的特異性條帶，與cpa基因片段大小一致，但未擴(kuò)增出cpb、etx和iA基因的特異性條帶（圖3）。將擴(kuò)增得到的陽(yáng)性基因片段測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示其為產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa基因，表明分離株SD14-02與蘇84-A一致，為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.5 分離菌株全菌蛋白的SDS-PAGE分析

對(duì)分離菌株SD14-02進(jìn)行全菌蛋白SDS-PAGE分析，以產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗株蘇84-A為對(duì)照，經(jīng)電泳鑒定，兩者的全菌蛋白條帶在40～100 ku 之間有明顯差異（圖4）。

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株SD14-02培養(yǎng)物進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并將分離菌以不同的劑量腹腔注射ICR小鼠，由表3可知，所有ICR小鼠于2 d內(nèi)死亡，從小鼠肝臟中可分離到純凈的產(chǎn)氣莢膜梭菌。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外研究仍未明確兔流行性腹脹病的病原，但部分研究發(fā)現(xiàn)病兔盲腸內(nèi)容物經(jīng)處理后通過(guò)口服可以成功復(fù)制該病[6]。國(guó)外學(xué)者等通過(guò)蔗糖密度梯度離心法對(duì)盲腸內(nèi)容物中微生物進(jìn)行了分層，通過(guò)口服攻擊斷奶兔，初步證明兔流行性腹脹病是由細(xì)菌感染引起而非病毒或寄生蟲(chóng)感染引起[6，9]。在此基礎(chǔ)上，也排除了一些通過(guò)盲腸菌群比對(duì)得到的特殊分離菌是該病病原的可能性，如R6B陽(yáng)性葡萄球菌[10]。另外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分抗生素如泰樂(lè)菌素、復(fù)方新諾明、恩拉霉素等對(duì)兔流行性腹脹病的治療有一定效果[1，2，11]，也提示該病為一種細(xì)菌性傳染病。之后，有學(xué)者在對(duì)盲腸內(nèi)容物的細(xì)菌菌群進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)兔盲腸中梭菌屬所占比例顯著高于正常對(duì)照組[7]，且產(chǎn)氣莢膜梭菌與兔流行性腹脹病的病因密切相關(guān)[5，6，12]。單獨(dú)分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌經(jīng)口服途徑攻擊，部分?jǐn)嗄掏每沙霈F(xiàn)兔流行性腹脹病特有的盲腸內(nèi)容物干硬阻塞的病理變化，但未表現(xiàn)出該病的其他特征[13]。這些研究提示產(chǎn)氣莢膜梭菌可能是兔流行性腹脹病的重要致病原之一，但并非是唯一的致病原。

本研究通過(guò)產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性分離培養(yǎng)基成功從保存的兔流行性腹脹病樣品中分離到1株產(chǎn)氣莢膜梭菌，且分離菌株在小鼠上具有致病性。由于兔流行性腹脹病與常見(jiàn)的導(dǎo)致家兔腸毒血癥的產(chǎn)氣莢膜梭菌病在臨床癥狀和病理變化上有明顯差異，因此本研究對(duì)分離菌株和產(chǎn)氣莢膜梭菌病疫苗菌株進(jìn)行了毒素基因分型，結(jié)果顯示所分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌與疫苗株均為A型，但兩者的全菌蛋白條帶在40～100 ku之間有明顯差異，暗示從兔流行性腹脹病樣品中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌SD14-02與蘇 84-A疫苗株有一定差異。本研究將為進(jìn)一步分析新型產(chǎn)氣莢膜梭菌與疫苗株的差異及其與致病性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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