超聲輔助提取泡桐葉熊果酸工藝研究

陳靜 董家新 趙豐麗

摘要 [目的]采用超聲輔助提取泡桐葉中熊果酸，為泡桐熊果酸的開發(fā)利用提供基礎。[方法]通過單因素試驗和正交試驗研究乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比、超聲波功率和提取次數(shù)對熊果酸得率的影響。[結(jié)果]經(jīng)方差分析和驗證試驗確定了從泡桐葉中提取熊果酸的最佳提取條件為乙醇濃度90%、料液比1∶20（g∶mL）、提取時間40 min、提取溫度65 ℃、提取次數(shù)3次、超聲波功率350 W，在該提取工藝條件下熊果酸得率為0.742%。[結(jié)論]超聲法提取是一種效率高、條件溫和且操作簡單的大眾化的提取熊果酸的方法。

關鍵詞 泡桐葉;熊果酸;超聲波輔助;提取;正交試驗

Abstract [Objective]In order to provide a basis for the development and utilization of ursolic acid from Paulownia tomentosa， ultrasonic assisted extraction was adopted to extract the ursolic acid from Paulownia tomentosa. [Method] The efects of ethanol concentration， extraction time， extraction temperature， solidliquid ratio， ultrasonic power and extraction times on the yield of ursolic acid were studied by single factor and orthogonal experiments. [Result]The optimum extraction conditions of ursolic acid from Paulownia tomentosa leaves were determined by variance analysis and validation test， the concentration of ethanol was 90%， the solidliquid ratio was 1：20， the extraction time was 40 min， the extraction temperature was 65 ℃， the extraction times was 3 times， and the ultrasonic power was 350 W. Under the condition of the extraction process， the ursolic acid yield was 0.742%. [Conclusion]Ultrasound extraction is a popular method to extract ursolic acid with high efficiency， mild conditions and simple operation.

Key words Paulownia tomentosa leaves;Ursolic acid;Ultrasonicassisted;Extraction;Orthogonal experiment

熊果酸（ursolic acid），別名烏索酸和烏蘇酸。純品是棱柱狀或細毛樣針狀結(jié)晶，有光澤，粗品為黃綠色或棕黃色粉末，有特殊氣味，是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物[1]，具有抗癌[2]、抗氧化美白[3]、抗菌抗炎[4]、降糖[5]等多種藥理作用，目前備受關注。有關熊果酸的提取近年來已成為天然產(chǎn)物開發(fā)領域的研究熱點，我國泡桐資源豐富，熊果酸又是其主要的功能性成分之一[6]，從泡桐中提取熊果酸，充分利用泡桐資源，具有重要意義。

熊果酸的提取方法很多，目前從各種原料中提取熊果酸的方法主要有回流提取法[7]、索氏提取[8]、浸提法[9]、超聲波提取法[10]、微波提取[11]、超臨界萃取法[12]、亞臨界水萃取[13]、雙水相萃取法[14]、常溫超高壓提取法[15]、沉淀吸附法[16]、微波預處理-回流提取聯(lián)合工藝法[17]等。實驗室常用的主要是回流法、索氏提取法、微波輔助提取以及超聲輔助法，其中微波提取法升溫較快，對產(chǎn)物生物活性不利，而回流提取法、浸提法和索氏提取所用時間較長、效率低下，其他方法如超臨界流體萃取等萃取法和超高壓提取法等對設備要求高、成本高。因此該研究主要采用超聲輔助提取法，鑒于目前熊果酸提取的影響因素缺少全面研究，大多只研究了乙醇濃度、料液比、提取時間和溫度4個因素[7-11]，提取所用溶劑主要是乙醇，少數(shù)用甲醇[18-19]和丙酮[20]。該研究以毛泡桐（P.tomentosa（Thunb.）Steud）葉為原料，采用超聲波輔助提取法，通過單因素和正交試驗研究乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度以及超聲波功率對熊果酸得率的影響，以期為毛泡桐葉熊果酸的開發(fā)利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試材

泡桐（P.tomentosa（Thunb.）Steud）葉采摘于廣西師范大學南苑，清洗干凈，40 ℃烘干，粉碎過40目篩備用;熊果酸標準品（AR）購于廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司;95%乙醇（AR）、無水乙醇（AR）、甲醇（色譜級）均購于西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器

KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）;2K-82（AB）型真空干燥箱（鄭州長城科貿(mào)有限公司）;2F-2型三用紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠）;日本島津系統(tǒng)高效液相色譜儀，包括CBM-20A控制器、LC-20雙泵、SPD-20AC檢測器。

1.3 試驗方法

1.3.1 熊果酸含量的測定——HPLC法。

1.3.1.1 標準曲線的繪制。

（1）標準溶液的配制。準確稱取熊果酸標準品5.0 mg，用甲醇定容至5 mL，制成熊果酸質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準溶液，分別精密吸取該溶液0.10、0.20、0.40、0.50、0.75 mL加甲醇定容至10 mL，配制成0.010、0.020、0.040、0.050、0.075 mg/mL的標準溶液[21] 。

（2）色譜條件。色譜柱為Waters SunFireTM C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為甲醇-磷酸水溶液（88∶12，V/V，pH=3），檢測波長210 nm;流速0.8 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量20 μL。此條件下，熊果酸與其他成分分離度較好（R>1.2），理論塔板數(shù)不低于7 000。

（3）標準曲線的繪制。以峰面積積分值為縱坐標（Y）、熊果酸標準品濃度（X，mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得到熊果酸峰面積與熊果酸濃度的關系為：Y=1.123×107X-3.39×104。

1.3.1.2 供試樣品溶液的制備。

精確稱取經(jīng)提取分離并干燥的熊果酸粗品5.0 mg，用甲醇定容至100 mL，配制成0.05 mg/mL的粗品溶液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，取濾液為供試液。

1.3.1.3 熊果酸得率的計算。其公式如下：

熊果酸得率=（提取液中熊果酸的質(zhì)量/泡桐葉粉末的質(zhì)量）×100%（1）

1.3.2 超聲波輔助提取最佳提取工藝的確定。

1.3.2.1 單因素試驗。

泡桐葉粉末經(jīng)水煮沸10 min以除去水溶性雜質(zhì)后，抽濾，收集濾渣冷凍干燥備用。精確稱取10.00 g的濾渣，采取超聲波輔助提取，分別考察乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）、提取時間（D）、超聲波功率（E）、 提取溫度（F）對熊果酸得率的影響，將所得提取物進行初步純化后測定其中熊果酸含量，方法同“1.3.1.1”。各因素水平的設置參考相關文獻[10]，詳見表1。

1.3.2.2 正交試驗。

在單因素試驗基礎上固定對試驗結(jié)果影響小的提取溫度、提取時間和超聲波功率，選擇對試驗結(jié)果影響大的乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)3個因素，按L9（34）[22]進行正交試驗，其因素水平設置詳見表2。

1.3.2.3 驗證試驗。將正交試驗極差分析所得的最優(yōu)方案、正交表中結(jié)果最好的方案以及方差分析得出的方案進行驗證試驗，每個試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取單因素試驗

各因素對熊果酸得率的影響如圖1所示，乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)對熊果酸得率影響較明顯，而提取時間、提取溫度以及超聲波功率對熊果酸得率的影響不明顯，得率隨因素變化的范圍僅在0.1%左右。故正交試驗中主要研究乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)對熊果酸得率的影響。另外在乙醇濃度、料液比的整個區(qū)間范圍內(nèi)，熊果酸的得率隨著參數(shù)值的增大一直呈上升趨勢，故正交試驗中需要提高這2個因素的上限值。而提取時間、提取溫度、超聲波功率以及提取次數(shù)對熊果酸得率的影響中，得率先上升后有所下降，當溫度為65 ℃時，再提高溫度熊果酸得率反而下降，所以選65 ℃為最佳提取溫度;當提取時間超過40 min后，熊果酸得率開始下降，故選40 min為最佳提取時間;當超聲波功率為350 W時，增加超聲波功率熊果酸得率卻下降，故選超聲波最佳功率為350 W。

2.2 正交試驗

固定提取溫度65 ℃、提取時間40 min、超聲波功率350 W，對乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)進行正交試驗，正交試驗結(jié)果如表2所示。通過極差分析得出3個因素對熊果酸得率影響從大到小依次為提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度，最優(yōu)方案為A2B3C3。而方差分析顯示，在給出的水平范圍內(nèi)，料液比和乙醇濃度對熊果酸得率的影響均不顯著（FA F0.05），選擇最佳水平，所以確定熊果酸的最佳提取方案為A1B1C3。而正交表中結(jié)果最好的方案是A1B3C3。

2.3 驗證結(jié)果

3組試驗的驗證試驗結(jié)果如表3所示，A1B3C3、A1B1C3、A2B3C3試驗方案所得熊果酸得率分別為0.740%、0.742%、0.749%，3種方案所得熊果酸得率差異都很小，故選擇方差分析推測的方案A1B1C3，即熊果酸的最佳提取條件為乙醇濃度90%、料液比1∶20、提取次數(shù)3次、提取時間40 min、提取溫度65 ℃、超聲波功率350 W，在此條件下熊果酸的得率為0.742%。

3 小結(jié)

超聲法提取相對于回流提取和索氏提取效率高、溫度低，也比微波提取升溫慢，利于保護物質(zhì)活性，相對于超臨界流體萃取法等[12-15]成本低、操作簡單，故是一種比較適宜的大眾化的提取熊果酸的方法。超聲法提取中，在一定條件下，乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)對熊果酸得率影響較大，超聲功率、提取時間和提取溫度對試驗結(jié)果影響較小。故實際提取時，本著保護物質(zhì)活性、節(jié)約成本和提高效率的基礎上，主要考慮乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)三因素。需要指出的是試驗因素的主次順序與選取的水平有關，如果因素水平選取發(fā)生改變，因素的主次順序可能隨著改變。在單因素試驗中，各因素水平跨度相對較大，乙醇濃度、提取次數(shù)、料液比對試驗結(jié)果影響明顯;而在正交試驗時，對乙醇濃度和料液比的水平范圍縮小以期找出更準確的參數(shù)時，提取次數(shù)成為了影響相對最顯著的因素。

該研究采用超聲輔助法，通過單因素試驗和正交試驗分析了影響熊果酸得率的六大因素，并找出了毛泡桐葉超聲提取熊果酸的最佳提取參數(shù)，為熊果酸的提取和泡桐資源的開發(fā)利用奠定了理論基礎，但研究中并未考慮各因素間的交互作用，故若需要得到更詳細和準確的試驗數(shù)據(jù)則需要做更進一步的研究。

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