瀕危植物大花黃牡丹根際土壤中一株青霉菌的分離與鑒定

祿亞洲 張二豪 尹秀

摘要 [目的]從西藏林芝縣米瑞鄉(xiāng)大花黃牡丹根際土壤中分離耐鹽青霉菌菌株，并對(duì)其分類地位進(jìn)行鑒定。[方法]采用高鹽察氏培養(yǎng)基從大花黃牡丹根際土壤中分離青霉菌菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA轉(zhuǎn)錄間隔序列ITS測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定。[結(jié)果] ZP-01菌株菌落無特定形態(tài)，鏡下可見掃帚狀結(jié)構(gòu)，屬于青霉菌（MF942929.1），同源性達(dá)99%。[結(jié)論]耐鹽青霉菌ZP-01在瀕危植物大花黃牡丹根際土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)研究中具有重要意義。

關(guān)鍵詞 根際土壤;青霉菌;分離;鑒定

Abstract [Objective] To isolate Penicillium strain from the rhizosphere soil of Paeonia ludlowii in Mirui Township， Tibet， and identify its taxonomic status. [Method] The high salt Czapek s medium were used to isolate Penicillium strain from the rhizosphere soil of Paeonia ludlowii and identified by morphology and ITS sequencing. [Result] ZP01 formed membranous colony， the typical broom shaped penicillus was found under the microscope， after ITS sequencing， the homology of the Penicillium （MF942929.1） was 99%. [Conclusion] Salttolerant Penicillium ZP01 plays an important role in the study of soil microbial community structure in the rhizosphere of endangered plant Paeonia ludlowii.

Key words Rhizosphere soil;Penicillium;Isolation;Identification

青霉菌（Penicillium）屬于半知菌門絲孢菌綱的微生物[1]。因肉眼可觀其孢子顏色為藍(lán)綠色而得名。但并非所有青霉屬的霉菌都為藍(lán)綠色，也有白色或綠色[2]。常見于腐爛的水果、蔬菜、肉食及衣履上。筆者從大花黃牡丹根際土壤中分離得到一株青霉菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在為大花黃牡丹根際土壤微生物種群及其多樣性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大花黃牡丹植物根際土壤采集于西藏林芝市林芝縣米瑞鄉(xiāng)（94°38′33.03″ E，29°32′43.96″N），所有樣品均隨機(jī)采取并混勻，每組3個(gè)重復(fù)，將采集的樣品放置無菌袋中低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，12 h內(nèi)處理。

1.2 方法

菌種分離所用培養(yǎng)基為高鹽察氏培養(yǎng)基。采用土壤稀釋涂布法從大花黃牡丹土壤中分離微生物，將涂布好的高鹽察氏培養(yǎng)基平板倒置放于28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d。 待培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)出不同菌落時(shí)，采用平板劃線法純化菌種，獲得純培養(yǎng)后制片鏡檢，并保存菌種。

利用ITS1和ITS4引物對(duì)真菌rDNA的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，5 mmol/L dNTPs 1.0 μL，5 μmol/L IST1-F引物1.0 μL，5 μmol/L IST4-R引物1.0 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，Template DNA 1.0 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)（95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min），72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并純化PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物送至上海美吉測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離

通過稀釋涂布法從大花黃牡丹根際土壤中分離出一株霉菌，將其編為ZP-01，選定ZP-01作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

2.2 霉菌ZP-01的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察。菌絲在培養(yǎng)基內(nèi)外能廣泛蔓延，無假根或匍匐菌絲，不產(chǎn)生定形菌落。菌絲生長(zhǎng)直立的多細(xì)胞分生孢子梗。梗的頂端不膨大，但具有可繼續(xù)再分的指狀分枝，每枝頂端有2～3個(gè)瓶狀細(xì)胞，其上各生一串灰色分生孢子（圖1）。

2.2.2 真菌ITS序列的PCR擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析。

以菌株ZP-01總 DNA 為模板，ITS1、ITS4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約500 bp 的特異性擴(kuò)增條帶（圖2），圖2中2號(hào)條帶為菌株ZP-01 PCR產(chǎn)物目標(biāo)條帶，PCR結(jié)果表明該菌為真核微生物，然后將純菌種穿刺送至上海美吉測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果，經(jīng)過Blast比對(duì)，結(jié)果表明該菌屬于青霉屬。根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果，通過 Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明ZP-01與青霉屬（Penicillium sp.）真菌聚在一群，其同源性均在 97%～99%，其中，ZP-01菌與Penicillium halotolerans（MF942929.1）的同源性最高，達(dá)99%，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌為耐鹽青霉菌（Penicillium halotolerans）。

3 結(jié)論與討論

從大花黃牡丹根際土壤中分離得到的菌株ZP-01，通過顯微觀察和分子鑒定為真核微生物，ZP-01與青霉屬（Penicillium sp.）真菌聚在一群，其同源性均在 97%～99%，其中，ZP-01菌與Penicillium halotolerans（MF942929.1）的同源性最高，達(dá)99%，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌為耐鹽青霉菌（Penicillium halotolerans）。

淡紫擬青霉菌能產(chǎn)生類植物生長(zhǎng)素，對(duì)植物具有防病促生作用[3]。任文彬[4]研究表明，淡紫擬青霉E2-4野生型菌株的孢子懸浮液對(duì)線蟲卵囊的孵化有抑制作用，用此菌制備的固體菌劑對(duì)番茄根結(jié)線蟲有較好的防治效果。肖馬云[5]研究發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉菌對(duì)香蕉枯萎病菌有顯著的抑制作用，有較好的防治效果，該菌及其生物肥藥在香蕉根系土壤和根圍還有較強(qiáng)的定殖能力。研究表明淡紫擬青霉菌劑對(duì)不同時(shí)期煙草生長(zhǎng)均具有促生效果，在一定程度上提高煙草品質(zhì)，并顯著增加煙草產(chǎn)量[6]。

部分青霉菌株在土壤中有較好的溶解磷作用。何迪等[7]、龔明波等[8]研究發(fā)現(xiàn)草酸青霉菌HB1具有分解纖維素和溶解土壤中固定態(tài)磷的雙重功能，還發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)單子葉植物還是雙子葉植物都具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。青霉菌與生物炭復(fù)合修復(fù)可以降低有效砷含量，并使砷污染土壤中的微生物環(huán)境有所改善，對(duì)砷污染土壤顯示出較好的修復(fù)性能[9]。

根系土壤是微生物的重要棲息地。不同來源的土樣中，微生物的種類和數(shù)目有很大差異[10]。根際是植物生長(zhǎng)過程中微生物、植物和土壤互相作用，同時(shí)也是微生物生長(zhǎng)的特殊生態(tài)環(huán)境[11-14]。

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