朝天罐總酚的提取純化及其抗氧化活性研究

陳艷華 蔣霞 陳依雨

摘要 [目的]優(yōu)化朝天罐總酚的提取純化工藝并評價其抗氧化活性。[方法]采用單因素和正交試驗(yàn)方法優(yōu)化朝天罐總酚回流提取工藝，并使用大孔樹脂對朝天罐總酚進(jìn)行分離純化。采用清除DPPH、ABTS·及Fe3+還原能力試驗(yàn)，與維生素C的抗氧化能力進(jìn)行比較，評價朝天罐總酚的抗氧化活性。[結(jié)果]最佳提取工藝條件為乙醇濃度35%，提取溫度80? ℃，料液比1∶50（g∶mL），提取時間 3 h，提取次數(shù)1次;AB-8型大孔樹脂為純化朝天罐總酚的最佳樹脂，最佳動態(tài)工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度2.0 mg/mL、上樣流速2 mL/min、洗脫液乙醇濃度60%、洗脫流速3 mL/min、洗脫用量120 mL。在最佳工藝條件下，純化后的朝天罐總酚含量為74.26%，對比于粗提物中的總酚含量（15.36%）提高了3.83倍。朝天罐總酚的抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，其清除DPPH自由基的能力較維生素C強(qiáng)，對ABTS+自由基和鐵離子也有較好的清除能力和還原能力，經(jīng)AB-8樹脂純化后，其抗氧化能力顯著提高（P<0.01）。[結(jié)論]優(yōu)選的提取純化工藝穩(wěn)定可行、提取率高，朝天罐總酚抗氧化性能較強(qiáng)，為朝天罐總酚的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 朝天罐;總酚;提取工藝;大孔樹脂;抗氧化

Abstract [Objective]The research aimed to optimize extraction and purification technology of total phenols from Osbeckia opipara and evaluate its antioxidant activity.[Method]The total phenols extraction technology was optimized by single factor experiment and orthogonal experiment.In addition，the total phenols were purified by macroporous resin.Antioxidant activity of total phenols from Osbeckia opipara was evaluated through several in vitro antioxidant assays，such as DPPH radical scavenging activity，ABTS radical scavenging activity and ferric reducing antioxidant effect with vitamin C as a reference.[Result]Optimum extraction conditions of total phenols were as follows： ethanol concentration of 35%，extraction temperature of 80 ℃，solidliquid ratio of 1∶50 （g∶mL），extraction time of 3 h and number of extractions of once.The results showed that A B8 type resin was the most suitable resin for the purification of total phenols from Osbeckia opipara.The optimum dynamic conditions were as follows： sample concentration of 2.0 mg/mL，sample flow rate of 2 mL/min，with 60% ethanol as eluent，elution rate of 3 mL/min and eluent volume of 120 mL.Under the optimal conditions，the total phenols content was 74.26%，which was 3.83 times higher than that of crude extract （15.36%）.Antioxidant capacity of total phenols from Osbeckia opipara was concentrationdependent，its DPPH radical scavenging ability was stronger than vitamin C.It also had a better scavenging activity of ABTS and ferric reducing antioxidant effect.After purification，its antioxidant activities were improved significantly than before（P<0.01）.[Conclusion]The preferred extraction and purification process is stable and feasible，with high extraction rate，and the antioxidant capacity of total phenol from Osbeckia opipara is strong，which provides a scientific basis and theoretical basis for the application of total phenol from Osbeckia opipara.

Key words Osbeckia opipara;Total phenols;Extraction technology;Macroporous resin;Antioxidant

朝天罐（Osbeckia opipara C.Y.Wu et C.Chen）為野牡丹科金錦香屬植物，又名倒罐草、張?zhí)靹?、七孔蓮、向天葫蘆等，產(chǎn)于浙江、福建、臺灣、江西、湖南、廣東、海南、廣西、貴州及四川南部，生于海拔250～800 m的山坡、山谷、水邊、路邊、疏林中或灌木叢中，越南至泰國也有分布[1]，為廣西少數(shù)民族地區(qū)常用本草藥材。主要以根入藥，其味甘、微苦，性平，歸腎、大腸經(jīng)，具有清熱利濕、散淤止血、解毒散結(jié)等功效，主治腰膝酸軟、咯血、痢疾、腸炎、咽喉痛等;亦可全株入藥，用于治療小兒風(fēng)熱、痔瘡出血、月經(jīng)不調(diào)、癌癥等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，酚類為朝天罐根的主要化學(xué)成分之一[3]。大量研究表明，酚類化合物為植物中重要的藥理活性物質(zhì)，具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抗菌、抗病毒[7]、降血糖、降血脂[8]等作用。目前關(guān)于朝天罐酚類提取物的研究鮮見文獻(xiàn)報(bào)道，筆者對朝天罐總酚的提取工藝和分離純化工藝進(jìn)行了研究，確定最佳提取純化條件，并評價其抗氧化活性，旨在為朝天罐活性成分的綜合利用及進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器? EL204電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 材料 朝天罐藥材采于廣西金秀瑤族自治縣，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)天然藥物與生藥學(xué)教研室焦愛軍教授鑒定為朝天罐根;沒食子酸對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號519D021）;大孔吸附樹脂：D101、AB-8、HPD-100、HPD-450、HPD-600、HPD-700（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）;1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（東京化成工業(yè)株式會社）;ABTS快速法試劑盒、FRAP法試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 朝天罐總酚提取工藝優(yōu)選

1.3.1 朝天罐總酚的提取。工藝流程：經(jīng)預(yù)處理的朝天罐干燥根→粉碎→過60目篩→回流提取→過濾→旋蒸濃縮→定容→測定總酚含量。取朝天罐藥材粉末（60 目）約1 g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇20 mL，80 ℃水浴回流提取1 h，重復(fù)3次，過濾，濾渣用75% 乙醇洗滌，合并濾液，將提取液經(jīng)50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，75%乙醇定容至 25 mL，搖勻，即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。采用福林酚法[9]測定總酚含量。精密稱取沒食子酸對照品2.83 mg，加入超純水溶解定容至25 mL;取朝天罐總酚提取液和沒食子酸對照品溶液適量，分別置于10 mL 容量瓶中，加入0.5 mL福林-酚試劑，搖勻，6 min 后加入20% Na2CO3 溶液1.5 mL，超純水定容至刻度，搖勻，于室溫下避光反應(yīng)1 h后，以相應(yīng)的試劑為空白對照，于400～900 nm光譜掃描，結(jié)果對照品與樣品溶液在750 nm 處均有最大吸收，故選擇測定波長750 nm。精密量取沒食子酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL分別加入10 mL 容量瓶內(nèi)，按上述方法顯色后，依法測定吸光度，以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.083 7X+0.031 9（r=0.999 5），且在1.132～9.056 μg/mL其線性關(guān)系良好。

1.3.3 單因素試驗(yàn)。精密稱取朝天罐藥材粉末約1 g （過60目篩） 回流提取，在其他提取條件固定的前提下，分別選取乙醇濃度（35%、45%、55%、 65%、75%、85%、95%）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）]、提取時間（1、2、3、4、5 h）、提取次數(shù)（1、2、3次）5個因素，考察其對朝天罐總酚含量的影響。各提取液按“1.3.2”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算朝天罐總酚含量。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對朝天罐總酚含量有顯著影響的因素和水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。確定對乙醇濃度（A） 、提取溫度（B） 、料液比（C） 及提取時間（D） 4 個因素進(jìn)行考察，每個因素選擇3個水平，采用L9（34 ） 正交表安排試驗(yàn)，具體正交試驗(yàn)因素水平見表1。

1.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)。精密稱取3 份朝天罐粉末30 g，根據(jù)優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.4 優(yōu)化朝天罐總酚純化工藝

1.4.1 大孔樹脂預(yù)處理[10]。大孔樹脂先用95%乙醇浸泡24 h，濕法裝柱后用95%乙醇洗至流出液加適量水無白色渾濁，再用水洗至無醇味。加5% 鹽酸浸泡4 h后，用水洗至中性，再加5% 氫氧化鈉溶液浸泡4 h，最后用水洗至中性備用。

1.4.2 大孔吸附樹脂的選擇[11]。稱取D101、AB-8、HPD-100、HPD-450、HPD-600和HPD-700各 2.00 g 置于100 mL具塞錐形瓶中，設(shè)置平行3組試驗(yàn)，最后結(jié)果計(jì)算平均數(shù)。加入 30 mL濃度為 0.5 mg/mL的朝天罐總酚粗提液，于恒溫振蕩器（25 ℃，120 r/min） 振蕩吸附24 h，抽濾，取濾液測定總酚含量。用水清洗3次樹脂，用濾紙吸干樹脂表面水分，轉(zhuǎn)入100 mL 具塞三角瓶中，加入50%的乙醇30 mL，于恒溫振蕩器（25 ℃，120 r/min） 振蕩解吸12 h，取上清液測定總酚含量。計(jì)算不同樹脂的吸附量、吸附率、解吸量及解吸率。

1.4.3 AB-8大孔樹脂對朝天罐總酚的動態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)。將處理后的大孔樹脂10 g濕法裝入（2.5 cm×30.0 cm）層析柱內(nèi)，超純水平衡后進(jìn)行動態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)[12]，分別考察朝天罐總酚上樣液濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）、上樣流速（1、2、3、4、5 mL/min）、上樣量（每 10 mL收集1管流出液，共收集50管）、洗脫液濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液）、洗脫流速（1、2、3、4、5 mL/min）與洗脫用量（每 10 mL收集1管流出液，共收集20管）對吸附與解吸效果的影響，繪制泄漏和洗脫曲線，計(jì)算動態(tài)吸附率和解吸率。

1.4.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。精密稱取3 份朝天罐粉末30 g，按最佳提取純化工藝條件進(jìn)行提取和純化，計(jì)算總酚得率和純度。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH 自由基清除能力。測定方法參照文獻(xiàn)[13]，并稍作改動。精確吸取質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL的朝天罐總酚粗提物及純化物供試品溶液各1 mL，分別與3 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH 無水乙醇溶液混合，充分搖勻后避光放置30 min，于波長517 nm處以 A空白（1 mL蒸餾水+3 mL無水乙醇）調(diào)零測定吸光度。以VC 為陽性對照，根據(jù)公式（1）計(jì)算清除率。

DPPH 自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%（1）式中，A1為樣品（1 mL 樣品+3 mL DPPH 工作液）吸光度;A2為樣品對照組（1 mL 樣品+3 mL 無水乙醇）吸光度;A0為空白對照組（1 mL 蒸餾水+3 mL DPPH工作液）吸光度。

1.5.2 ABTS+ 自由基清除能力。參照ABTS快速法試劑盒說明書，并參考研究方法[14]。在96孔板的每個檢測孔中加入20 μL過氧化物酶工作液;空白對照孔中加入10 μL蒸餾水，樣品檢測孔內(nèi)加入10 μL各種樣品（各樣品濃度為40、60、80、100、120、140、160、180 μg/mL），混勻;每孔內(nèi)再加入170 μL ABTS工作液，輕輕混勻;室溫孵育6 min后測定波長414 nm 處的吸光度。以VC 為陽性對照，根據(jù)公式（2）計(jì)算清除率。

ABTS+ 清除率=[1-（A1- A2）/A0]×100%（2）式中，A0為空白對照吸光度;A1為樣品吸光度;A2為樣品對照組吸光度。

1.5.3 鐵離子還原能力（FRAP）。參照FRAP法試劑盒說明書，并參考文獻(xiàn)[15]，稍作改動。精確稱取27.8 mg FeSO4·7H2O溶解定容至10 mL，濃度即為10 mmol/L。在96孔板的每個檢測孔中加入180 μL FRAP工作液;空白對照孔中加入5 μL蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入5 μL各種濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 mmol/L），樣品檢測孔內(nèi)加入5 μL各種樣品（各樣品濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160、180 μg/mL），混勻;37 ℃孵育5 min后測定波長593 nm處的吸光度。以VC 為陽性對照，樣品鐵離子還原能力用mmol/L FeSO4表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 朝天罐總酚提取工藝優(yōu)選

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果。由圖1a可見，總酚含量開始隨著乙醇濃度的升高而逐漸增加，在45% 時達(dá)到最高;但隨著乙醇濃度進(jìn)一步增加，總酚含量逐漸降低，這可能是由于部分朝天罐酚性成分親水性較好造成。因此將乙醇濃度水平設(shè)置在35%～55%。

由圖1b可知，在50～90 ℃，隨著溫度的升高，總酚含量也隨之增加。在50～80 ℃總酚含量顯著升高，80～90 ℃總酚含量上升趨于平緩，因此提取溫度水平設(shè)置在70～90 ℃。

由圖1c可知，隨著料液比的增加，朝天罐總酚含量逐漸升高，在料液比為1∶50（g∶mL）時達(dá)到最大值，可能是隨著溶劑體積的增加，溶劑與溶質(zhì)充分接觸，溶出速度加快，使總酚含量升高。當(dāng)料液比超過1∶50時，總酚在溶劑中的溶解度已達(dá)到飽和，且隨著其他提取物的增多，不利于總酚溶出，總酚含量呈下降趨勢。因此將料液比設(shè)置在1∶40～1∶60。

圖1d顯示，隨著提取時間的增加，總酚含量逐漸升高，當(dāng)提取時間達(dá)到3 h 時，總酚含量達(dá)到最大值，此時提取效果最好。當(dāng)提取時間進(jìn)一步延長（>3 h），溶劑中酚性成分濃度逐漸增大，和固相中的濃度差逐漸變小，有效成分難以進(jìn)一步溶解。因此將提取時間設(shè)置在2～4 h 。

圖1e結(jié)果表明，提取1、2、3次后，總酚含量逐漸升高，但上升平緩，考慮工藝成本和節(jié)約資源，將提取次數(shù)設(shè)置為提取1 次。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果。由表2可知，乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間對朝天罐總酚含量均有不同程度的影響，其中乙醇濃度對總酚提取率的影響最大，其次為料液比、提取時間，提取溫度對總酚含量的影響最小。影響總酚含量的因素作用主次為A>C>D>B，即乙醇濃度>料液比>提取時間> 提取溫度。確定最佳提取工藝為A1B3C2D2，由于溫度對總酚的提取影響較小，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中能耗的減少及生產(chǎn)效率，故提取溫度設(shè)置為80 ℃，即加50倍量35% 乙醇在溫度為80 ℃下回流提取3 h，1次。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)。根據(jù)優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表3，朝天罐總酚平均得率為32.13%，RSD 為1.42%;平均純度為15.36%，RSD 為2.08%;表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定性好，合理可行。

2.2 朝天罐總酚純化工藝優(yōu)化

2.2.1 大孔吸附樹脂的篩選。由表4可見，不同型號的樹脂由于極性、比表面積、平均孔徑不同，對朝天罐總酚的吸附和解吸能力各不相同。其中，HPD-600雖然有較高的吸附能力，吸附率可達(dá)92.86%，但是其解吸率較低，為87.45%，較難將總酚解吸出來，所以HPD-600不適合用于朝天罐總酚的純化。AB-8、D101 和HPD-100的吸附能力相近，但解吸率AB-8>HPD-100>D101，由于適宜的純化樹脂不僅要對目標(biāo)成分吸附量大，而且要求解吸率高，以保證目標(biāo)成分最大程度地被回收，因此綜合考慮選擇AB-8為朝天罐總酚的最佳純化樹脂。

2.2.2 AB-8大孔樹脂對朝天罐總酚的動態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)。從圖2a可以看出，隨著朝天罐總酚濃度的升高，吸附率隨之增大，但在上樣液濃度大于2.0 mg/mL時，吸附率增加趨于平緩，且觀察到上樣液開始出現(xiàn)渾濁，上樣后在柱床上層出現(xiàn)沉淀，對大孔樹脂造成污染和堵塞，不利于樹脂的吸附。因此，上樣液濃度選擇2.0 mg/mL為宜。

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