油用牡丹黑斑病病原菌的分離鑒定

常雪 任愛芝 張汕

摘要 [目的]明確油用牡丹常見的黑斑病病原菌。[方法]通過組織分離法對油用牡丹黑斑病病原菌進行分離、純化，按照柯赫氏法則進行致病性鑒定，并利用形態(tài)觀察結(jié)合分子生物學(xué)手段對病原菌進行鑒定。[結(jié)果]油用牡丹黑斑病的病原菌為鏈格孢（Alternaria alternata）。[結(jié)論]該研究結(jié)果為油用牡丹病害綜合防控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 油用牡丹;黑斑病;病原菌;形態(tài)學(xué)鑒定;分子鑒定

Abstract [Objective] To identify the pathogen of oilseed peony black spot.[Method]The pathogen of oilseed peony black spot was isolated and purified by tissue isolation method.The pathogenicity was proved by the Kochs rule.The pathogen was identified based on morphological characteristics and molecular systematic.[Result]The pathogen of oilseed peony black spot was identified as Alternaria alternata.[Conclusion] The results of this study provided a foundation for the comprehensive prevention and control of oilseed peony diseases.

Key words Oilseed peony;Black spot; Pathogen;Morphological identification;Molecular identification

油用牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）屬于芍藥科（Paeonia ceae）芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect.Moutan DC），是結(jié)實能力強、出油率高的一類牡丹的統(tǒng)稱[1]。牡丹籽油不飽和脂肪酸含量高達92%，特別是α-亞麻酸含量高達42%以上[2]。α-亞麻酸是一種人體所必需的不飽和脂肪酸，具有保護心血管及神經(jīng)元，抗氧化，治療骨質(zhì)疏松、炎癥和癌癥的功效[3]，但在人體內(nèi)不能自身合成，必須從食物中獲取[4]。除具有α-亞麻酸所具有的功能外，牡丹籽油還具有殺菌、抗腫瘤、治療心血管疾病[5-6]、降低膽固醇、護肝[7-10]等保健功能，而且比花生等常見食用油抗氧化性強，更耐儲存[11-12]?？梢娔档ぷ延褪且环N品質(zhì)非常優(yōu)良的高端食用油。另外，牡丹籽油可以添加于日用防護品中起到美白防曬的功效[13-14]。2011年牡丹籽油獲得新資源食品批準(zhǔn)[15]，牡丹籽油正式進入商業(yè)化生產(chǎn)和銷售，油用牡丹成為國家木本油料戰(zhàn)略發(fā)展的重要品種，油料牡丹種植產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展。

隨著油用牡丹種植面積的逐年擴大，其病害的發(fā)生情況日益嚴(yán)重，極大地阻礙了該產(chǎn)業(yè)的健康、有序和快速發(fā)展[16]。黑斑病是油用牡丹常見的一種真菌病害，一般在8—9月高溫、多濕時發(fā)病，主要侵染葉片，產(chǎn)生灰黑色圓形病斑。為了保護油用牡丹種植業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保證牡丹籽油的無污染及高品質(zhì)，筆者對油用牡丹黑斑病病害開展了研究，分離純化得到其病原菌，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的手段對病原菌進行鑒定，旨在為油用牡丹黑斑病的綜合防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年5—10月在聊城市東阿、冠縣、東昌府區(qū)田莊苗圃等油用牡丹種植地塊采集新鮮病葉，記錄發(fā)病情況并拍照，并于冰箱4 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化。采用組織分離法對油用牡丹黑斑病病原菌進行分離[17]。用自來水沖洗干凈病葉后，在病健交界處剪取3～5 mm的小塊。把剪取的病葉在超凈工作臺中用75%乙醇沖洗10 s，再用次氯酸鈉溶液沖洗30 s，最后用無菌水沖洗3次，待水分揮發(fā)干后放置于含有1‰乳酸的PDA平板上，每皿3塊，置于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出菌落后進一步純化得到純菌種。把純化的病原菌接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，待菌落長滿培養(yǎng)基后，于冰箱4 ℃冷藏備用。

1.2.2 病原菌的致病性測定。將培養(yǎng)7 d的病原菌用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，選取長勢一致的油用牡丹健株，將菌餅的菌絲面貼置于健康葉片上，用塑料袋罩住整棵植株后，在25 ℃條件下恒溫保濕培養(yǎng)。每天記錄觀察。待接種后的葉片發(fā)病后，觀察其癥狀，并按照柯赫氏法則，重新分離純化，檢測分離的病原菌是否和接種的病原菌相一致。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定。將分離純化的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，觀察菌落生長速度、形態(tài)、產(chǎn)生的色素等。挑取病原菌制片，顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子梗和分生孢子等形態(tài)特征，拍照記錄。

1.2.4 病原菌分子鑒定。采用CTAB法[18]提取病原菌基因組DNA，利用真菌18S rDNA序列通用引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和NS4（5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′）進行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 30 s，退火47 ℃1 min，延伸72 ℃ 1 min，32個循環(huán);繼續(xù)延伸72 ℃10 min。回收測序，NCBI數(shù)據(jù)庫對序列進行BLAST，并采用DNAman對下載的18S rDNA序列進行同源比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 油用牡丹病害的癥狀

通過對魯西北油用牡丹病害開展調(diào)查，發(fā)現(xiàn)黑斑病發(fā)生普遍且嚴(yán)重，病害主要危害葉片（圖1）。初期葉面或葉柄上會形成近圓形病斑，中央灰白色，邊緣灰黑色，田間遇雨濕度大時病部會形成黑色霉層，并產(chǎn)生同心狀輪紋。該病病斑擴展較慢，一般8—9月發(fā)病重。病情嚴(yán)重時可造成葉片穿孔、脫落，以致整株死亡。

2.2 病原菌致病性鑒定

將純化的病原菌用5 mm打孔器制備菌餅，接種到健康油用牡丹植株葉片（圖2A），3 d后葉片菌餅接觸部位開始出現(xiàn)病斑，5 d后可明顯看到圓形黑色病斑，形成黑色霉層，正面為黑褐色，背面為淺褐色（圖2B、C），14 d后葉片產(chǎn)生明顯的同心狀輪紋，并出現(xiàn)穿孔（圖2D）。對發(fā)病后的葉片重新組織分離，得到與接種菌培養(yǎng)性狀相同的病原菌（圖2E）。

2.3 病原菌形態(tài)特征

病原菌于PDA培養(yǎng)基上最初菌落正面為白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸變?yōu)槟G色，最后變?yōu)榘岛稚梁谏?，菌落背面呈墨綠色至黑色。菌絲有隔，分生孢子梗暗褐色，單生或數(shù)根叢生，有分支，直立或彎曲，頂生分生孢子，分生孢子單生或鏈狀著生，卵形，長橢圓形或倒棍棒形，淡褐色，1～4個縱、斜隔膜和3～8個橫隔膜，分隔處略縊縮或不縊縮（圖3）。

2.4 病原菌的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

在對病原菌通過形態(tài)特征鑒定的基礎(chǔ)上進一步開展分子系統(tǒng)學(xué)鑒定，以提取的菌株DNA為模板擴增18S rDNA序列，得到大小約為1 000 bp的預(yù)期條帶（圖4）。

將電泳條帶回收測序，經(jīng)BLAST分析顯示，油用牡丹黑斑病的病原菌與鏈格孢屬Alternaria sp.相似性為99%，結(jié)合形態(tài)特征確定油用牡丹黑斑病的病原菌為鏈格孢（Alternaria alternata）（圖5）。

3 結(jié)論與討論

油用牡丹種植產(chǎn)業(yè)剛起步，目前關(guān)于油用牡丹病害的研究較少，目前研究多集中于對病害癥狀的描述，對病原菌種類的鑒定也多限于形態(tài)學(xué)特征的觀察[19-20]，但對于其病原、發(fā)生規(guī)律以及防治的研究尚不深入[21]。黑斑病是觀賞牡丹上普遍發(fā)生的重要病害，有關(guān)觀賞牡丹黑斑病病原菌長期只鑒定到屬，陳松[20]報道牡丹黑斑病病原菌為一種鏈格孢，但沒有明確其具體歸于哪一個種。直到2015年石良紅等[22]采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)手段將泰安地區(qū)觀賞牡丹黑斑病病原鑒定為鏈格孢（A.alternata）;2017年宣俊好等[23]將洛陽牡丹黑斑病的病原鑒定為鏈格孢。該研究通過形態(tài)學(xué)結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)將油用牡丹黑斑病的病原菌確定為鏈格孢（Alternaria alternata）。該研究結(jié)果與觀賞牡丹黑斑病的鑒定結(jié)果吻合，表明該病原菌是牡丹上共同的病原類型。

鑒于鏈格孢屬內(nèi)有許多相似種，其形態(tài)學(xué)特征類似，特別是一些分類學(xué)家提出該屬的分類僅根據(jù)ITS序列和18S rDNA序列還不能確定其種的歸屬，要根據(jù)多基因序列比對結(jié)果才能確認，其更進一步的鑒定有待繼續(xù)開展，但目前所取得的鑒定結(jié)果對于該病害綜合防控具有重要指導(dǎo)意義。

參考文獻

[1] 李育材.中國油用牡丹工程的戰(zhàn)略思考[J].中國工程科學(xué)，2014，16（10）：58-63.

[2] 程安瑋，孫金月，王維婷，等.牡丹籽油的研究進展[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34（3）：79-84.

[3] KIM K B，NAM Y A，KIM H S，et al.αLinolenic acid：Nutraceutical，pharmacological and toxicological evaluation[J].Food and chemical toxicology，2014，70：163-178.

[4] 楊靜，常蕊.α-亞麻酸的研究進展[J].農(nóng)業(yè)工程，2011，1（1）：72-76.

[5] 張紅玉，王成章，張宇思，等.超聲波提取油牡丹籽殼多酚工藝響應(yīng)面法優(yōu)化及抗氧化性研究[J].中國油脂，2015，40（6）：90-94.

[6] 朱素英.牡丹花多酚提取優(yōu)化與抗氧化性[J].生物技術(shù)，2014，24（3）：78-82.

[7] 余麗，李國達，方凌燕，等.白藜蘆醇心血管保護作用機制及臨床研究進展[J].中國心血管雜志，2016，21（1）：76-79.

[8] 路祺，高悅，項鳳影，等.牡丹種莢多糖提取工藝研究[J].植物研究，2015，35（1）：154-157.

[9] 李靜，姚茂君，王旭東，等.牡丹籽油自氧化及抗氧化性能的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（22）：84-87.

[10] WANG S J，SHI Y，HAN L P.Development and evaluation of microencapsulated peony seed oil prepared by spray drying：Oxidative stability and its release behavior during invitro digestion[J].Journal of food engineering，2018，231：1-9.

[11] 高婷婷.牡丹籽油成分分析及儲藏條件研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2012.

[12] 楊鹿，王洪新，蘇建輝，等.牡丹籽油優(yōu)勢抗氧化劑研究[J].中國油脂，2015，40（2）：46-49.

[13] 代慧慧，魏安池，李曉棟，等.牡丹籽油開發(fā)應(yīng)用的研究進展[J].糧食與油脂，2016，29（1）：4-6.

[14] 王順利，任秀霞，薛璟祺，等.牡丹籽油成分、功效及加工工藝的研究進展[J].中國糧油學(xué)報，2016，31（3）：139-146.

[15] 中華人民共和國衛(wèi)生部公告2011年第9號[J].中國食品添加劑，2011（2）：264.

[16] 韓長志，左安建，劉云霞.油用牡丹主要真菌病害的發(fā)生與防治綜述[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（18）：98-99，104.

[17] ELIK M.Preparation and characterization of starchgpolymethacrylamide copolymers[J].J Polym Res，2006，13（5）：427-432.

[18] HIRATA T，CUNNINGTON J H，PAKSIRI U，et al.Evolutionary analysis of subsection Magnicellulatae of Podosphaera section Sphaerotheca（Erysiphales）based on the rDNA internal transcribed spacer sequences with special reference to host plants[J].Can J Bot，2000，78（12）：1521-1530.

[19] 張秀燕，周翠.油用牡丹主要病害防治方法[J].河北果樹，2018（1）：61-62.

[20] 陳松.油用牡丹常見病害與防治[J].山東林業(yè)科技，2016（5）：89-93.

[21] 韓長志，左安建，劉云霞.油用牡丹研究進展[J].北方園藝，2016（20）：194-197.

[22] 石良紅，趙蘭勇，吳迪，等.山東牡丹黑斑病的病原菌鑒定與ITS序列分析[J].園藝學(xué)報，2015，42（3）：585-590.

[23] 宣俊好，張元博，蒙城功，等.洛陽地區(qū)牡丹3種主要葉部病害病原菌的分離與鑒定[J].植物保護，2017，43（6）：91-96.