全氟辛烷磺酸對斑馬魚AchE及LDH的影響研究

潘偉一 韓菊 沈洪艷

摘要 [目的]探究PFOS對斑馬魚神經(jīng)和能量代謝的影響。[方法]該研究采用室內(nèi)暴露試驗方法，將斑馬魚暴露于0、0.56、1.67、5.00、15.00 mg/L濃度的PFOS試驗液中，測定斑馬魚體內(nèi)AchE活性和LDH活性，試驗周期為15 d。[結(jié)果]PFOS對斑馬魚頭部AchE活性有誘導(dǎo)作用，0.56、1.67 mg/L低濃度暴露組對AchE活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，而5.00、15.00 mg/L高濃度暴露組與低濃度暴露組相比，PFOS對AchE活性有抑制作用。PFOS對斑馬魚肌肉組織LDH活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的作用，與對照組相比，在暴露前6 d PFOS誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)LDH活性，促進了斑馬魚能量代謝，從暴露第9天到試驗結(jié)束，斑馬魚體內(nèi)LDH活性受到抑制，能量代謝減弱，且隨著暴露濃度的升高，抑制作用越明顯，呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)關(guān)系。[結(jié)論]在整個試驗周期內(nèi)，與對照組相比PFOS可以誘導(dǎo)AchE活性，抑制興奮的傳遞從而破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，暴露9 d后，PFOS對AchE活性的誘導(dǎo)作用隨著暴露濃度的升高而減弱。PFOS短期暴露可促進斑馬魚能量代謝能力，長期暴露抑制斑馬魚無氧代謝。

關(guān)鍵詞 全氟辛烷磺酸;斑馬魚;神經(jīng)系統(tǒng);能量代謝;AchE;LDH

Abstract [Objective]To have a better understanding of the toxicity effect of PFOS to zebrafish nerve and energy metabolism.[Method]Indoor exposure test was conducted.Zebrafish was exposed to PFOS at different concentrations of 0，0.56，1.67，5.00，15.00 mg/L，respectively.[Result]After 15 days，the results showed that the AchE was induced by PFOS，the 0.56，1.67mg/L lower concentration groups induced the AchE，but compared with lower concentration groups，5.00，15.00 mg/L groups inhibited the activity of AchE.The activity of LDH was increased firstly and then decreased.After exposure for 6 days，the LDH was induced by PFOS，and promoted zebrafish energy metabolism.Until the end of the experiment，the activity of LDH is subjected，and reduced energy metabolism.There is a concentrationeffect relationship between PFOS and the zebrafish energy metabolism.[Conclusion]All the results indicated that throughout the experimental cycle，compared with the control group，PFOS can induce AchE activity and damage nervous system.After exposure for 9 days，the induction of AchE activity by PFOS decreased with the increase of exposure concentration.Shortterm exposure to PFOS can promote zebrafish energy metabolism，and longterm exposure can inhibit zebrafish anaerobic metabolism.

Key words PFOS;Zebrafish;Nerve;Energy metabolism;AchE;LDH

全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate ，PFOS）是一種應(yīng)用廣泛的新型持久性有機污染物[1]。PFOS化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有C-F化學(xué)鍵，使其具有較強的熱、化學(xué)穩(wěn)定性以及疏水、疏脂等特性[2]，被廣泛用于紡織品、地毯、皮革制品和家具等表面防污處理劑的生產(chǎn)中，同時可作為中間體用于生產(chǎn)涂料、泡沫滅火劑、地板上光劑、農(nóng)藥和滅白蟻藥劑等[3]，所以PFOS在世界各大水系及我國長江、珠江、黃浦江、嘉陵江以及三峽庫區(qū)等水體中均有檢出[4-5]，PFOS在北大西洋中的濃度范圍是8.6～36 pg/L[6]，在我國東江流域濃度為0.97 ng/L[7]，在黃浦江濃度達20.5 ng/L[5，8]，PFOS可以通過呼吸作用和進食被生物體攝取，并具有毒性作用[9]，其毒性作用在食物鏈傳遞中被放大，易在生物體內(nèi)富集并難以分解[10-11]。

PFOS具有免疫毒性，可降低小鼠淋巴細胞增殖功能和NK細胞活性[12]，PFOS早期低劑量慢性暴露可引起大鼠成年后學(xué)習(xí)記憶力減退，海馬神經(jīng)發(fā)育不足，組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起海馬環(huán)路的損傷[13]，還能改變中華倒刺鲃幼魚能量代謝水平的下限[14]。但PFOS對生物神經(jīng)毒性效應(yīng)和能量代謝的影響還有待進一步研究，因此該研究選取斑馬魚為受試生物，研究水體中PFOS對乙酰膽堿酯酶（AchE）、乳酸脫氫酶（LDH）的影響，為PFOS對水生生物亞急性毒性提供毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用斑馬魚購自某生物研究所，AchE、LDH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，PFOS試劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其余試劑均為分析純。

試驗儀器包括移液槍（Pipet-Lite，TopPette Pipettor）、溫度計、玻璃勻漿器、量筒、燒杯、5 L玻璃燒杯、低溫冰箱（BBC-226STV）、曝氣泵、恒溫水浴鍋（HH-4）、精密電子天平（JJ323BC）、臺式高速冷凍離心機（2-16PK）、酶標(biāo)儀（Spectramax190）。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗。試驗用魚試驗前在充分曝氣的自來水中馴養(yǎng)15 d，以充分適應(yīng)實驗室環(huán)境，馴養(yǎng)期間斑馬魚自然死亡率低于2%，并在試驗前24 h停止喂養(yǎng)。為保證受試生物在試驗過程中不死亡，設(shè)置試驗最高暴露組濃度為96 h半致死濃度的1/5，根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，PFOS 96 h LC50為75.864 mg/L，所以設(shè)置該試驗暴露組濃度為0、0.56、1.67、5.00、15.00 mg/L，并設(shè)置溶劑對照組，每個暴露組設(shè)3個平行，重復(fù)3次試驗，采用靜態(tài)試驗的方法，試驗期間，在玻璃魚缸中分別加入4 L對應(yīng)濃度的試驗液體，將馴養(yǎng)后的斑馬魚投放至各暴露組，每組25條，于暴露后的第3、6、9、12、15天，將斑馬魚頭部剪掉保留，內(nèi)臟等內(nèi)部器官取出保留肌肉組織，并分別對斑馬魚頭部和肌肉組織進行稱重，加入組織重量9倍的生理鹽水進行研磨、離心，按照試劑盒要求將樣品稀釋至相應(yīng)倍數(shù)后測定斑馬魚頭部AchE活力、肌肉組織中LDH活性。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理。

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進行處理;作圖使用Origin 8.6;使用GraphPad Prism 5對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，與對照組相比，P<0.05表示差異顯著，標(biāo)記為*，P<0.01表示差異極顯著，標(biāo)記為。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFOS對斑馬魚頭部AchE活力的影響

乙酰膽堿酯酶（AchE）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶，目前已成為反映水生生物受到污染物脅迫危害程度的經(jīng)典毒理學(xué)指標(biāo)[15]，AchE廣泛存在于各種動物組織中，在神經(jīng)突觸間隙中，通過催化水解乙酰膽堿來終止其對膽堿受體的興奮作用，維持神經(jīng)沖動的正常傳遞，AchE活性升高則抑制興奮的傳遞，活性降低則使生物體表現(xiàn)為過度興奮 [16-17]。各暴露組PFOS對斑馬魚頭部AchE活性的影響見圖1。

由圖1可知，在整個試驗周期內(nèi)溶劑對照組與空白組斑馬魚頭部AchE活性無顯著差異，且趨于一致，由此判定助溶劑對斑馬魚毒性可忽略不計，不影響PFOS對AchE活性的毒性效應(yīng)。在整個試驗周期內(nèi)，與對照組相比，PFOS對斑馬魚頭部AchE活性均表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。暴露第3天，各暴露組AchE活性均顯著高于對照組，其中15.00 mg/L暴露組AchE活性出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），AchE活性值為1.11 U/mg，且隨著暴露濃度的升高，PFOS對斑馬魚AchE活性誘導(dǎo)作用越明顯，有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。AchE活性高于對照組，表明PFOS對斑馬魚頭部AchE有誘導(dǎo)作用，致使神經(jīng)突觸間隙中乙酰膽堿數(shù)量減少，從而抑制了興奮的傳遞。暴露第6天，1.67、5.00 mg/L暴露組AchE活性高于對照組但無顯著差異，但0.56、15.00暴露組AchE活性顯著高于對照組（P<0.05）。暴露至第9天，各暴露組AchE活性均高于對照組，但15.00 mg/L的高濃度暴露組AchE活性低于0.56、1.67 mg/L 的低濃度暴露組。暴露至第12和15天，除15.00 mg/L暴露組外，其余各暴露組AchE活性均高于對照組。其中5.00、15.00暴露組AchE活性均低于1.67 mg/L暴露組，這表明雖然PFOS對AchE活性有誘導(dǎo)作用，但當(dāng)暴露濃度高于1.67 mg/L 時，與其余低濃度暴露組相比，PFOS對AchE活性表現(xiàn)為抑制作用，證明暴露一定時間后，PFOS對AchE活性的誘導(dǎo)作用隨著暴露濃度的升高而減弱。Xiaochun Guo等[18]研究發(fā)現(xiàn)，全氟化合物可破壞斑馬魚神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、抑制神經(jīng)元發(fā)育，余向陽等[19]研究發(fā)現(xiàn)，毒死蜱和三唑磷對斑馬魚頭部AchE活性均有抑制作用，且隨著暴露濃度的增加、暴露時間的延長，對AChE活性抑制作用越明顯，與該文中暴露前6 d PFOS對AchE活性作用結(jié)果及PFOS通過誘導(dǎo)AchE活性，間接影響神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的數(shù)量，破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的結(jié)論一致。

2.2 PFOS對斑馬魚肌肉組織LDH活性的影響

乳酸脫氫酶（LDH）在肌體能量代謝過程中起重要作用，其活性的改變可以間接反映肌體能量代謝情況[20-21]。生物體正常條件下，LDH含量較低，當(dāng)細胞出現(xiàn)能量代謝障礙或者細胞損傷時，LDH的含量會升高[22-23]。各暴露組PFOS對斑馬魚肌肉組織LDH含量的影響見圖2。

由圖2可知，在整個暴露周期內(nèi)，PFOS對斑馬魚體內(nèi)LDH活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的作用。在暴露第3天，各暴露組LDH活性均高于對照組，其中15.00 mg/L暴露組LDH活性與對照組相比表現(xiàn)顯著差異（P<0.05），這表明斑馬魚肌體為了應(yīng)對PFOS刺激，以增加LDH活性的方式來增加肌體能量代謝[17]，同時斑馬魚細胞可能受到損傷。暴露至第6天，各暴露組LDH活性變化同第3天類似，其中0.56和15.00 mg/L 暴露組LDH活性顯著高于對照組（P<0.05）。暴露至第9天，0.56、1.67、5.00 mg/L暴露組LDH活性顯著低于對照組，其中0.56、1.67 mg/L暴露組與對照組間差異極顯著（P<0.01），5.00 mg/L暴露組與對照組間差異顯著（P<0.05），此時PFOS對斑馬魚體內(nèi)LDH活性表現(xiàn)為抑制作用，原因可能是斑馬魚持續(xù)受到PFOS脅迫，導(dǎo)致斑馬魚肌體無氧代謝能力減弱。暴露至第12天，0.56、1.67、5.00 mg/L暴露組LDH活性依然顯著低于對照組（P<0.05）。暴露至第15天，15.00 mg/L暴露組與空白組相比出現(xiàn)了顯著差異（P<0.01），各暴露組斑馬魚機體內(nèi)LDH活性均低于空白組，且隨著暴露組濃度的升高，LDH活性顯著降低（P<0.01），呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)關(guān)系。分析原因可能是受到PFOS脅迫后，斑馬魚肌體能量代謝增強以應(yīng)對PFOS對肌體造成的損傷，但隨著暴露時間的延長，增加能量代謝并不能消除PFOS帶來的不利效應(yīng)，且這種效應(yīng)對斑馬魚肌體造成損傷，致使斑馬魚肌體能量代謝減慢。謝松等[21]發(fā)現(xiàn)，三硝基甲苯對LDH活性有抑制作用，與該研究中暴露9 d后LDH活性變化趨勢相近。

3 結(jié)論

（1）在整個試驗周期內(nèi)，PFOS通過誘導(dǎo)斑馬魚頭部AchE活性，使乙酰膽堿的數(shù)量減少，抑制興奮的傳遞從而破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。與對照組相比，PFOS對斑馬魚頭部AchE活性均表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。暴露9 d以后，PFOS對AchE活性的誘導(dǎo)作用隨著暴露濃度的升高而減弱。

（2）在暴露前6 d，PFOS對斑馬魚體內(nèi)LDH活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，從暴露第9天到暴露結(jié)束，PFOS對斑馬魚體內(nèi)LDH活性表現(xiàn)為抑制作用，且隨著暴露組濃度的升高，抑制作用越明顯，呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)關(guān)系。PFOS短時間（暴露前6 d）暴露可促進斑馬魚能量代謝能力，長時間（暴露第6天到試驗結(jié)束）暴露使斑馬魚無氧代謝能力減弱。

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