基于金納米粒子/Fe-MIL-88-NH₂的比率型C反應(yīng)蛋白免疫傳感器

鄧燕 馬玉嬋 王敏 谷夢巧 遲寬能 胡蓉 楊云慧

摘?要?以金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）功能化的金屬有機骨架材料（Fe-MOFs，F(xiàn)e-MIL-88-NH2）為基質(zhì)材料，構(gòu)建了雙信號比率型免疫傳感器，用于C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）的檢測。八面體結(jié)構(gòu)的Fe-MOFs不僅提供了較大的有效表面積，可增加固定生物分子的量，促進電子和離子的傳輸，而且表現(xiàn)出良好的導電性。將AuNPs修飾到Fe-MOFs上可以進一步增加比表面積，以捕獲大量抗體以及提高電子轉(zhuǎn)移能力。隨CRP濃度的增加，K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的氧化峰電流減小，而Fe-MOFs的氧化峰電流相對恒定。采用K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs的響應(yīng)電流比值作為定量測定CRP的響應(yīng)信號。以K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6作為信號探針（K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP），AuNPs 修飾的Fe-MOFs作為內(nèi)參比探針（Fe-MOFs-rP），這種比率探針將sP和rP整合到一個結(jié)構(gòu)中，確保了完全相同的修飾條件以及sP和rP在同一個傳感界面上的相互依賴性，因此具有更強的消除環(huán)境干擾的能力。所構(gòu)建的免疫傳感器線性響應(yīng)范圍為1～200 ng/mL，檢出限為0.3 ng/mL（S/N=3）。此傳感器具有良好的選擇性，有望用于心血管疾病的早期篩查和診斷。本研究為制備檢測其它生物標志物的比率信號放大傳感器奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?C-反應(yīng)蛋白;金屬有機骨架材料;比率型電化學免疫傳感器

1?引 言

心血管疾病是造成人類死亡的主要原因之一。歐洲心臟病學會和美國心臟病學會建議根據(jù)C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平范圍評估患者心血管疾病的嚴重程度[1，2]。CRP是一種分子量約為120 kDa的急性期炎癥蛋白，主要由肝臟中響應(yīng)白細胞介素6（IL-6）的刺激而產(chǎn)生。近年來，許多研究證實，根據(jù)CRP的測定可有效預(yù)測人群中的心血管疾病[3，4]。CRP水平還與炎癥性腸病[5]、結(jié)腸癌[6]有很強的相關(guān)性。所以，臨床醫(yī)生可通過測量CRP值了解疾病活動。在健康人血清中，CRP的濃度不超過1 μg/mL，當機體有急性炎癥、冠心病及腫瘤發(fā)生時，血清中的CRP含量可增加近1000倍[7]。由于人血清基質(zhì)復雜，且生物標志物的濃度較低，因此，發(fā)展靈敏、準確、快速的CRP檢測方法在臨床上具有重要意義。

金屬有機骨架（MOFs）是含有芳香酸或堿的氮、氧多齒有機配體，通過配位鍵與無機金屬中心雜化自組裝而成的具有立體微孔結(jié)構(gòu)的晶體材料[8，9]。研究表明，相比較于傳統(tǒng)的多孔配位化合物或多孔材料而言，MOFs 晶體材料具有很多獨特的特征，如超高孔隙率、大的比表面積、良好的熱穩(wěn)定性、均勻的結(jié)構(gòu)以及易于制造和結(jié)構(gòu)可控[10，11]。功能性MOFs已經(jīng)被應(yīng)用在氣體儲存和分離[12]、樣品前處理[13]、癌癥治療[14]、催化[15]、藥物輸送[16]和化學傳感[17]等領(lǐng)域。由于MOFs的構(gòu)建是通過金屬單元與有機連接體連接，因此氧化-還原型MOFs中具有氧化-還原性的金屬離子可以產(chǎn)生較大的電流響應(yīng)。但大多數(shù)MOF材料由于其水溶性差，且棒狀結(jié)構(gòu)限制了電子轉(zhuǎn)移，使其自身的導電性較差。Fe-MIL-88-NH2是一種不規(guī)則的八面體形態(tài)的Fe-MOFs，在水溶液中具有較高的催化活性和穩(wěn)定性，以及良好的生物相容性，可用于生物傳感器的制備[18]。

近年來，多種比率型電化學檢測的“信號放大”與“信號減小”策略已用于對腫瘤標志物的定量檢測[19]。含有不同電活性物質(zhì)的比率型電化學傳感器具有雙信號輸出，并可通過測量不同氧化還原電位下的雙氧化還原電流峰值強度的比率確定分析物的濃度，可以對內(nèi)在背景信號的影響提供內(nèi)置校正，以減少環(huán)境影響和背景噪聲，提供更準確的信號，有利于提高電化學傳感的準確度和靈敏度[20～22]。比率法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種分析技術(shù)，如熒光、電化學和化學發(fā)光[23～25]。

本研究構(gòu)建了雙信號比率型電化學免疫傳感器，采用金納米粒子（AuNPs）功能化的Fe-MIL-88-NH2作為基質(zhì)材料，利用AuNPs和抗體中的巰基形成金硫鍵固定CRP抗體，F(xiàn)e-MOFs可以產(chǎn)生較大的電流響應(yīng)，作為內(nèi)部參考探針（Fe-MOFs-rP）;而K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6作為信號探針（K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP），設(shè)計了一種新穎的雙信號比率型電化學非標記免疫傳感策略。AuNPs被修飾到Fe-MOFs中，增加材料的電導率，以促進電子的轉(zhuǎn)移，進一步提高所制備的生物傳感器的靈敏度。此策略將Fe-MOFs-rP和K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP組合作為比率測定探針，可以確保完全相同的修飾條件和Fe-MOF-rP和K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP之間的直接相互依賴關(guān)系，顯著減少環(huán)境干擾。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

使用CHI660D電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）進行電化學測量，采用三電極體系（玻碳電極（GCE）、飽和甘汞電極、鉑絲輔助電極）;CS501超級恒溫器（重慶實驗設(shè)備廠）;?ST2200HP超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）;?ME104E電子分析天平（博特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;TGL16離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）;VTX-E混旋儀（倍捷科技公司）;DZF-6020型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）;TTRⅢ型X射線衍射儀（日本理學公司）;JEM2100透射電鏡（日本電子株式會社）;掃描電子顯微鏡（日本Hitachi Science Systems公司）。

C-反應(yīng)蛋白（CRP）與C-反應(yīng)蛋白抗體（anti-CRP）購于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司;2-氨基對苯二甲酸（C8H7NO4，武漢阿瑞斯生物科技有限公司）;?FeCl3·6H2O（上海江富實業(yè)有限公司）;HAuCl4·3H2O（上海國藥集團有限公司）;乙醇（C2H5OH）、檸檬酸三鈉（天津市風船化學試劑科技有限公司）;谷氨酸（L-Glutamic acid，Glu）、甘氨酸（Glycine，Gly）、癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、殼聚糖（Chitosan，CHIT）、牛血清蛋白（Bovine serum albumin;BSA）、磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS，pH 7.4）均購于美國Sigma公司;K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]·3H2O、KCl（天津大茂化學試劑科技有限公司）;?N，N二甲基甲酰胺（DMF，天津津東天正精細化學試劑廠）。除特殊說明外，所使用的試劑均為分析純，實驗用水均為超純水（電阻>18 M Ω·cm）。人血清樣品由云南師范大學校醫(yī)院提供（所有實驗均在相關(guān)法律規(guī)定要求下進行）。

2.2?實驗方法

2.2.1?Fe-MOFs（ Fe-MIL-88 NH2）的合成?參照文獻[26]的方法合成Fe-MIL-88 NH2。稱取0.126 g 2-氨基對苯二甲酸和0.187 g FeCl3·6H2O置于三頸燒瓶中，加入15 mL DMF，超聲數(shù)分鐘，使其分散均勻。在攪拌的條件下，取197 μL乙酸加入到上述混合溶液中。然后，將混合溶液于120℃油浴4 h 以結(jié)晶，冷卻到室溫后，分別用DMF和無水乙醇離心洗滌3次（8000 r/min，5 min）。最后，將所得樣品在真空干燥箱中60℃干燥12 h，得到紅棕色晶體。

2.2.2?CRP傳感器的制備?將玻碳電極用金相砂紙和不同粒徑的Al2O3拋光粉依次打磨成鏡面后，分別用50% （V/V） HNO3、乙醇、超純水超聲洗滌5 min，自然晾干。取8 mg Fe-MIL-88-NH2分散到2 mL滅菌水中，超聲處理得到分散液。將10 μL 0.5%（w/V）殼聚糖-分散液（1∶1，V/V）的混合液滴加到處理過的玻碳電極表面，自然晾干。根據(jù)文獻[27]報道的方法制備金納米溶膠。滴加20 μL 1% 金納米溶膠，使金納米顆粒（AuNPs）吸附在Fe-MOFs（Fe-MIL-88-NH2）上，用PBS溶液沖洗，晾干后，再滴加10 μL 60 μg/mL CRP抗體（anti-CRP），于4℃保存過夜，干燥，將抗體固定在AuNPs/Fe-MIL-88-NH2上。用PBS緩沖溶液沖洗電極，自然晾干后，再滴加10 μL 1%（w/V）BSA，在37℃恒溫培育1 h，封閉非特異性結(jié)合位點。繼續(xù)用PBS緩沖溶液沖洗，自然晾干后，與不同濃度的C-反應(yīng)蛋白抗原孵育 30 min，可制得CRP免疫傳感器。其制備流程如圖1所示。

2.2.3?CRP的電化學檢測

在制備好的傳感器上滴加10 μL不同濃度的CRP抗原進行孵育，將修飾好的電極浸入10 mL含有5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl 溶液中，檢測電活性探針的差分脈沖（ Differential pulse voltammetry，DPV）信號，電壓范圍0.2～1.2 V，振幅50 mV，脈沖寬度0.05 s，脈沖周期0.1 s。采用K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs的響應(yīng)電流比值作為定量測定CRP的響應(yīng)信號。

3?結(jié)果與討論

3.1?材料的表征

3.1.1?Fe-MIL-88-NH2和AuNPs/Fe-MIL-88-NH2的微觀形貌?圖2A和2B均為Fe-MIL-88-NH2的透射電鏡圖，可見所合成的Fe-MIL-88-NH2 顯示出不規(guī)則的八面體結(jié)構(gòu)，其平均直徑約為200 nm，與文獻[28]報道一致。圖2C和2D 為AuNPs/Fe-MIL-88-NH2的透射電鏡圖，可以發(fā)現(xiàn)，由于AuNPs與氨基具有強烈的吸附能力，平均直徑約為5～10 nm的AuNPs被均勻分散到Fe-MIL-88-NH2上。

3.1.2?Fe-MIL-88-NH2的粉末-X 射線衍射（XRD）表征?對合成的Fe-MIL-88-NH2材料進行了XRD表征，并與文獻中的標準圖譜比較。圖3中曲線a為本研究合成的材料的XRD圖譜，曲線b是文獻[18]中Fe-MIL-88-NH2的XRD圖譜。曲線a在11.10°處有很強的特征峰，與文獻[27]報道的結(jié)果一致。XRD的表征結(jié)果說明成功合成了Fe-MIL-88-NH2材料且結(jié)晶度較好。

3.2?Fe-MIL-88-NH2和AuNPs對免疫傳感器的信號放大作用

為了考察Fe-MIL-88-NH2和AuNPs對響應(yīng)信號的放大作用，測定了有無AuNPs和Fe-MIL-88-NH2修飾電極在K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液中的差分脈沖響應(yīng)（圖4）。曲線a為通過戊二醛將抗體固定在殼聚糖修飾的電極上的DPV響應(yīng)，此時只有K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的氧化峰（0.2 V）。曲線b為抗體通過戊二醛被固定在Fe-MIL-88-NH2 /殼聚糖修飾的電極上的DPV響應(yīng)，與曲線a相比，在0.9 V處新出現(xiàn)了一個Fe-MOF（Fe-MIL-88-NH2）峰，并且K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6在0.2 V的電化學信號明顯增強，這是因為Fe-MIL-88-NH2對K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的氧化還原反應(yīng)有一定的催化作用，因此響應(yīng)信號被放大。曲線c為抗體固定在AuNPs/Fe-MIL-88-NH2/殼聚糖修飾的電極上的響應(yīng)信號，與沒有AuNPs（曲線b）相比，信號明顯增強，這是由于AuNPs與Fe-MIL-88-NH2對K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的氧化還原反應(yīng)具有協(xié)同催化作用，從而使響應(yīng)信號增強。Fe-MOF可以作為導電基質(zhì)，有效降低復合材料的電子轉(zhuǎn)移阻力，AuNPs可以降低MOFs的尺寸，有利于增加復合材料的活性位點和比表面積。AuNPs-Fe-MOF獨特的異質(zhì)結(jié)構(gòu)有助于加快工作電極與溶液中K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6之間的電子轉(zhuǎn)移，進一步改善Fe-MOF的電催化性能。

為了考察在0.9 V處新出現(xiàn)的Fe-MOF（Fe-MIL-88-NH2）峰是鐵離子還是配體2-氨基對苯二甲酸產(chǎn)生的，將配體溶解于滅菌水中（2 mg/mL），與殼聚糖混合滴在玻碳電極上，在PBS中進行DPV測試，結(jié)果見圖5。在0.9 V處有一個氧化峰，說明圖4中Fe-MOF的峰是2-氨基對苯二甲酸產(chǎn)生的。

3.3?氧化還原峰電流與掃描速度的關(guān)系

在含有5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl 溶液中考察了掃描速度對免疫傳感器電化學行為的影響。如圖6所示，在20～140 mV/s范圍內(nèi)，隨著掃描速度的增加，氧化還原峰電流增大，而且氧化還原峰電流值與掃描速度的平方根呈線性關(guān)系（圖6內(nèi)插圖），說明傳感器的電流受擴散控制，此電化學過程是可逆過程。

3.4?不同修飾電極界面的交流阻抗行為和循環(huán)伏安行為分析

在5 mmoL/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl 溶液中，采用電化學交流阻抗（EIS）和循環(huán)伏安法考察了不同電極修飾界面的電化學行為。圖7A為不同修飾電極的電化學阻抗譜，內(nèi)插圖為EIS模型的等效電路圖。等效電路包含Warburg阻抗（ZW）、電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct，大小相當于高頻區(qū)阻抗曲線的半圓直徑）、溶液電阻（Rs，阻抗曲線的直線部分）和雙層電容（Cd1）。理想情況下，Rs和Zw不受電極表面的影響，因為它們代表探針的擴散和溶液的特性[29]。

在圖7A的阻抗譜中，曲線a為裸玻碳電極（GCE），接近一條直線，說明電子傳遞幾乎沒有阻礙，修飾Fe-MIL-88-NH2 /CHIT的玻碳電極由于覆蓋了Fe-MIL-88-NH2和殼聚糖，阻礙了電子的傳遞，阻抗增加（Rct=1100 Ω）（圖7A曲線b）;修飾了AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT的玻碳電極，

由于AuNPs比表面積大、催化效率高、傳導電子的能力強，從而使電極阻抗值減小（Rct=600 Ω）（圖7A曲線c）;圖7A曲線d為抗體固定在AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT/GCE的Nyquist曲線，由于CRP抗原與CRP抗體的特異性結(jié)合，使得電極表面的傳質(zhì)阻力增大，阻抗值增加（Rct=1400 Ω）;使用1%BSA封閉anti-CRP/AuNPs/Fe-MIL-88-NH2/CHIT/GCE電極表面的非特異性結(jié)合位點后，電極阻抗值進一步增加（Rct=1900 ?Ω）（圖7A曲線e）;在anti-CRP/AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT/GCE孵育CRP抗原后，阻抗又進一步增加（Rct=4800 ?Ω）（圖7A曲線f），說明抗原與抗體特異性結(jié)合后形成絕緣的免疫復合物，阻礙K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6電子傳遞。交流阻抗實驗與循環(huán)伏安實驗的結(jié)果一致，說明傳感器構(gòu)建成功。

圖7B為不同電極的循環(huán)伏安曲線。裸GCE（圖7B曲線a）呈現(xiàn)一對氧化還原峰，為探針[Fe（CN）6]3/4的電化學氧化還原峰;修飾Fe-MIL-88-NH2 /CHIT的GCE，電極的峰電流降低（圖7B曲線b），說明Fe-MIL-88-NH2被很好地固定在電極表面，阻礙了電子的傳遞;在GCE 上修飾AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT后，由于AuNPs比表面積大、催化效率高、傳導電子的能力強，峰電流相應(yīng)增加（圖7B曲線c）;進一步將抗體固定在AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT/GCE上，由于CRP抗原與CRP抗體的特異性結(jié)合，阻礙了K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的電子傳遞，峰電流值降低（圖7B曲線d），也說明抗體被固定在電極表面;使用1%BSA封閉anti-CRP/AuNPs/Fe-MIL-88-NH2/CHIT/GCE電極表面的非特異性結(jié)合位點后，峰電流值進一步降低（圖7B曲線e）。將anti-CRP/AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT/GCE CRP與抗原孵育后，峰電流信號值最低（圖7B曲線f），說明抗原與抗體特異性結(jié)合后形成絕緣的免疫復合物，阻礙K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6電子傳遞。這與循環(huán)伏安實驗與交流阻抗實驗的結(jié)果一致，說明傳感器構(gòu)建成功。

3.5?實驗條件的優(yōu)化

3.5.1?固定抗體濃度對免疫傳感器的影響?考察了免疫傳感器在不同固定抗體濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）下的電流比值。由圖8可見，傳感器響應(yīng)電流的比值隨著固定抗體濃度的增加而變小，當抗體濃度為60 μg/mL時，響應(yīng)電流的比值最小，之后響應(yīng)電流又隨固定抗體濃度的增加而增加。由于本實驗為信號減小型，響應(yīng)電流的比值最小時所對應(yīng)的固定抗體濃度為最佳。因此，選擇60 μg/mL作為本實驗的最佳固定抗體濃度。

3.5.2?抗體培育時間對傳感器響應(yīng)電流比值的影響

在固定60 μg/mL抗體濃度和其它條件不變的情況下，改變抗體培育時間，通過測定K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs（Fe-MIL-88 NH2）響應(yīng)電流比值（IK3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6/IMOFs）的大小，考察抗體培育時間對傳感器響應(yīng)電流的影響。由圖9可見，隨著抗體培育時間延長，響應(yīng)電流的比值先減小后增加，在10 h時達到最小值。所以，最佳抗體培育時間選擇10 h。

3.5.3?抗原培育時間對傳感器電流的影響?固定60 μg/mL抗體濃度，抗體培育時間為10 h，在其它條件保持不變的情況下，改變抗原培育時間，通過測定K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs（Fe-MIL-88 NH2）響應(yīng)電流比值的大小，考察不同抗原培育時間對傳感器的影響。由圖10可知，隨著抗原培育時間延長，響應(yīng)電流的比值先增加后減小，在30 min時達到最小值后，響應(yīng)電流的比值隨培育時間的延長而變大。因此，最佳抗原培育時間選擇30 min。

3.6?免疫傳感器的校正曲線

在最佳實驗條件下，測定電極對不同濃度的CRP抗原的響應(yīng)信號，每個濃度平行測定3次。結(jié)果如圖11所示，隨著抗原濃度增加，K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs響應(yīng)電流的比值（IK3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6/IMOFs）相應(yīng)減小，且與CRP抗原濃度在1～200 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9989，線性回歸方程為IK3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6/IMOFs=0.00559C+1.14714，檢出限為0.3 ng/mL（3σ）。

3.7?免疫傳感器的特異性

為了研究此免疫傳感器的特異性，將10 ng/mL CRP抗原分別與100 ng/mL谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、前列腺特異性抗原（PSA）及癌胚抗原（CEA）按體積比1∶1混合。

然后，測量DPV響應(yīng)電流，并與由CRP抗原產(chǎn)生的響應(yīng)電流進行比較。由圖12可知，10倍濃度的干擾物僅引起峰值電流的輕微變化，說明谷氨酸、甘氨酸、前列腺特異性抗原和癌胚抗原對CRP的檢測幾乎不造成干擾，表明此免疫傳感器具有良好的選擇性。

3.8?免疫傳感器的穩(wěn)定性和重復性

在5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl溶液中，傳感器在掃速0.1 V/s下，采用循環(huán)伏安法掃描200圈，電流保持原來的94.3%，使用3根電極平行測定3次，相對標準偏差為4.6%，長時間檢測后未發(fā)現(xiàn)電流有明顯改變，表明此納米復合材料具有良好的穩(wěn)定性。

3.9?加標回收實驗

為考察所研制的傳感器對實際樣品的測試性能，采用標準加入法，在1%的血清中加入等體積不同濃度的CRP抗原，在最佳實驗條件下，每個濃度平行測定3次，結(jié)果見表1，加標回收率分別為99.80%、99.92%、99.99%，說明此傳感器對CRP的響應(yīng)性能良好，可用于實際樣品中CRP的測定。

4?結(jié) 論

基于比率探針，將內(nèi)部參考探針（Fe-MOF-rP）和信號探針（K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP）組合，形成比率探針，并將其用于構(gòu)建集成的雙信號非標記免疫傳感器。與非比率傳感器相比，比率型電化學傳感器具有更高的準確度、靈敏度、穩(wěn)定性和選擇性。本研究使用AuNPs功能化的不規(guī)則的八面體形態(tài)的Fe-MOFs（Fe-MIL-88-NH2）作為固定基質(zhì)，其在水溶液中具有高催化活性、高穩(wěn)定性和良好的生物相容性，有利于生物分子的固定，并可以保持其生物活性。AuNPs/Fe-MIL-88-NH2復合材料作為電化學平臺具有好的性能和較高的靈敏度，用于實際血清樣品中CRP的測定，回收率令人滿意。本研究提供了一種新的比率探針，可為臨床上CRP的檢測提供參考。

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