啶蟲(chóng)脒固體制劑中違禁添加氟蟲(chóng)腈的紅外光譜定量方法研究

杜夏瑜 熊艷梅 夏靜靜 閔順耕

摘?要?利用紅外光譜結(jié)合衰減全反射技術(shù)（Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FT-IR）對(duì)啶蟲(chóng)脒固體制劑中氟蟲(chóng)腈的含量進(jìn)行快速測(cè)定。采用傅里葉變換紅外光譜儀采集69個(gè)固體樣品及其萃取液的光譜，探究不同預(yù)處理方法及變量選擇方法對(duì)樣品光譜的處理效果，建立固體樣品及萃取液的定量分析模型。通過(guò)Kennard-Stone算法劃分樣本集，采用偏最小二乘法建立氟蟲(chóng)腈的定量模型，使用外部檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，對(duì)于固體樣品，直接測(cè)定其中氟蟲(chóng)腈的定量模型的決定系數(shù)為0.9762，預(yù)測(cè)均方根誤差（Root mean square error of prediction set，RMSEP）為0.0022;經(jīng)N，N-二甲基甲酰胺（DMF）萃取，上清液樣品中氟蟲(chóng)腈定量模型的預(yù)測(cè)決定系數(shù)為0.9810，RMSEP為0.0019;對(duì)于氟蟲(chóng)腈含量范圍在060%～5.00%的樣品，外部檢驗(yàn)樣品預(yù)測(cè)平均相對(duì)誤差（MRE）為0.08。本方法可應(yīng)用于農(nóng)藥中違禁添加氟蟲(chóng)腈的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞?紅外光譜;偏最小二乘法;變量選擇;氟蟲(chóng)腈;啶蟲(chóng)脒

1?引 言

氟蟲(chóng)腈屬于GABA-氯離子通道抑制劑，與常用的多類(lèi)殺蟲(chóng)劑無(wú)交互抗性，殺蟲(chóng)譜廣，但對(duì)蜜蜂毒性高，且在水體和土壤中降解緩慢，環(huán)境友好性差[1，2]。啶蟲(chóng)脒是一種新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，作用于昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)，可有效防治大部分產(chǎn)生抗性的害蟲(chóng)。2009年2月25日農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告，對(duì)氟蟲(chóng)腈的使用進(jìn)行了限制，規(guī)定含氟蟲(chóng)腈成分的農(nóng)藥制劑僅能申請(qǐng)衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑的田間試驗(yàn)、農(nóng)藥登記和銷(xiāo)售使用[3]。但由于氟蟲(chóng)腈在啶蟲(chóng)脒制劑中混合度較好，二者使用條件相似，一些不良商家和企業(yè)將氟蟲(chóng)腈非法添加到啶蟲(chóng)脒制劑中以增強(qiáng)施用效果，這些含有氟蟲(chóng)腈的農(nóng)藥制劑的使用對(duì)人畜、環(huán)境等帶來(lái)許多不良影響，迫切需要開(kāi)發(fā)一種快速檢測(cè)氟蟲(chóng)腈含量的方法。

常規(guī)的氟蟲(chóng)腈檢測(cè)方法為色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4～8]，這類(lèi)方法需要的時(shí)間較長(zhǎng)，且對(duì)樣品的前處理要求較高，操作繁瑣，難以適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。紅外光譜技術(shù)具有測(cè)定速度快、檢測(cè)成本低、對(duì)前處理要求低、非破壞性檢測(cè)等特點(diǎn)，在食品、農(nóng)業(yè)、化學(xué)、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)應(yīng)用廣泛[9]，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)在數(shù)據(jù)處理方面具有很大優(yōu)勢(shì)，近幾年應(yīng)用于農(nóng)藥有效成分及違禁成分的檢測(cè)[10，11]。Li 等[12]利用紅外光譜結(jié)合區(qū)間組合優(yōu)化（Interval combination optimization，ICO）算法建立了啶蟲(chóng)脒乳油中氟蟲(chóng)腈含量的定量模型，最優(yōu)模型的決定系數(shù)為0.9982;但未涉及啶蟲(chóng)脒固體制劑中氟蟲(chóng)腈含量的定量測(cè)定，且乳油的基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單。

目前，對(duì)氟蟲(chóng)腈紅外光譜定量分析的算法一般為偏最小二乘法（Partial least squares，PLS），其建模方法對(duì)校正集要求較高，建模時(shí)間長(zhǎng)[12]，因此，在建模前需要?jiǎng)澐謽颖荆?duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理和變量選擇，采用Kennard-Stone （KS）法劃分樣本，以保證校正集樣本按照空間距離分布均勻[13]。 預(yù)處理方法包括平滑去噪算法（Smoothing）、Savitzky-Golay導(dǎo)數(shù)法（Savitzky-Golay derivative）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換法（Standard normal variation，SNV）、多元散射校正法（Multivariate scattering correction，MSC）等[14～16]，變量選擇方法包括區(qū)間偏最小二乘法（Interval partial least-squares，iPLS）、移動(dòng)窗口偏最小二乘法（Moving window partial least squares，MWPLS）、ICO等[17～19]。

本研究采用紅外光譜結(jié)合衰減全反射技術(shù)（ATR-FT-IR）對(duì)啶蟲(chóng)脒固體商品制劑中違禁添加的氟蟲(chóng)腈含量進(jìn)行檢測(cè)，分別采用固體直接測(cè)定和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶劑萃取液測(cè)定方法，對(duì)樣品中的氟蟲(chóng)腈進(jìn)行定量檢測(cè);采用4種光譜預(yù)處理方法、3種變量選擇方法對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，采用PLS法建立最優(yōu)定量模型。所建立分析方法可應(yīng)用于農(nóng)藥違禁添加氟蟲(chóng)腈的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Nicolet iS5TM型FT-IR光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司，配有Omni iD5-ATR金剛石附件，儀器參數(shù)為：掃描范圍4000～650 cm?1，分辨率2 cm?1，掃描次數(shù)32次）;SCDEALL VX-Ⅲ型多管渦旋振蕩器（安簡(jiǎn)（北京）科技有限公司）;TG16MW型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

40%啶蟲(chóng)脒可濕性粉劑（青島瀚生生物科技股份有限公司;農(nóng)藥登記證號(hào)：PD20096672）;70%啶蟲(chóng)脒可濕性粉劑（江西禾益化工股份有限公司;農(nóng)藥登記證號(hào)：PD20142282）;40%啶蟲(chóng)脒可溶粉劑（海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司;農(nóng)藥登記證號(hào)：PD20102099）;氟蟲(chóng)腈原藥（95%，w/w，中國(guó)農(nóng)科院植保所農(nóng)藥廠(chǎng)）;乙腈、無(wú)水乙醇、DMF（分析純，北京化工廠(chǎng)）;所有試劑均未經(jīng)過(guò)純化，直接使用。所有的玻璃器皿及儀器可清洗部分均分別使用去離子水和無(wú)水乙醇清洗3遍，干燥后使用。

2.2?數(shù)據(jù)處理軟件

10.3版The Umscrambler X、9.2版OMNIC、R2019a 版Matlab、2019版Excel和9.1版Origin。

2.3?光譜采集及數(shù)據(jù)處理

2.3.1?樣品制備?在3種不同來(lái)源的啶蟲(chóng)脒制劑中加入不同質(zhì)量的95%（w/w）氟蟲(chóng)腈原藥，研細(xì)后，置于渦旋振蕩器上振蕩5 min，配制氟蟲(chóng)腈濃度在0.1%～5.0%（w/w）之間的固體樣品，共69個(gè)，樣品質(zhì)量百分?jǐn)?shù)均值為1.315%，用于建立定量模型和驗(yàn)證。

分別用乙腈、甲苯、二甲苯和DMF 4種溶劑對(duì)適量氟蟲(chóng)腈原藥進(jìn)行溶解，其中DMF對(duì)氟蟲(chóng)腈的溶解效果最好，故選用其作為固體樣品的萃取溶劑，對(duì)上述69個(gè)樣品分別萃?。悍謩e稱(chēng)量適量樣品，加入1 mL萃取液，置于渦旋振蕩器上振蕩5 min，4000 r/min離心3 min，得到69個(gè)上清液，樣品質(zhì)量百分?jǐn)?shù)均值為1.344%，用于建立定量模型和驗(yàn)證。

2.3.2?光譜采集?使用FT-IR光譜儀采集69個(gè)樣品及對(duì)應(yīng)的69個(gè)上清液的紅外光譜。每個(gè)樣品采集3條光譜并求平均值，以氟蟲(chóng)腈在啶蟲(chóng)脒制劑中的含量作為分析指標(biāo)進(jìn)行處理。

2.3.3?數(shù)據(jù)處理?對(duì)樣品和上清液的光譜數(shù)據(jù)分別建立定量模型，其步驟概述為：基線(xiàn)校正預(yù)處理光譜后，采用4種預(yù)處理方法（平滑去噪、Savitzky-Golay導(dǎo)數(shù)、SNV、MSC）結(jié)合3種變量選擇方法（iPLS、MWPLS、ICO）優(yōu)化定量模型。

實(shí)驗(yàn)中用到的基線(xiàn)校正在The Umscrambler X中進(jìn)行，其余所有光譜處理的算法代碼均在Matlab中完成。模型評(píng)價(jià)采用RMSEP為指標(biāo)。

3?結(jié)果與討論

3.1?氟蟲(chóng)腈、啶蟲(chóng)脒制劑及樣品的衰減全反射中紅外光譜圖

圖1為氟蟲(chóng)腈、啶蟲(chóng)脒制劑及樣品的紅外譜圖。氟蟲(chóng)腈原藥在3360～3320 cm?1處有中強(qiáng)度的吸收峰，為NH伸縮振動(dòng);2240 cm?1處的吸收峰為CN伸縮振動(dòng);1690～1630 cm?1處的強(qiáng)吸收峰為CN的伸縮振動(dòng);1590 cm?1處中強(qiáng)度的吸收峰為NH的變形振動(dòng);1360～1320 cm?1處中強(qiáng)度的吸收峰為NCN的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng);1190～1140 cm?1處中強(qiáng)度的吸收峰為NCN的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng);865～810 cm?1處的吸收峰為四取代苯環(huán)的特征吸收峰。啶蟲(chóng)脒制劑在3200 cm?1處的寬峰為制劑中OH的吸收;2250～2100 cm?1處的強(qiáng)吸收峰為硅藻土基質(zhì)SiH伸縮振動(dòng);1580 cm?1處的中強(qiáng)吸收峰應(yīng)為制劑基質(zhì)中的胺類(lèi)或雙鍵物質(zhì);1360～1310 cm?1處的強(qiáng)吸收峰為CN的伸縮振動(dòng)。

1處的峰被啶蟲(chóng)脒制劑的基質(zhì)吸收掩蓋，因此對(duì)樣品進(jìn)行萃取以排除基質(zhì)的干擾。由圖1可見(jiàn)，萃取液的紅外光譜背景更干凈，譜圖質(zhì)量有所改善。

3.2?固體樣品中氟蟲(chóng)腈定量模型的建立及優(yōu)化

對(duì)69個(gè)固體樣品對(duì)應(yīng)的69條光譜，以啶蟲(chóng)脒制劑中氟蟲(chóng)腈含量為化學(xué)值，通過(guò)KS法劃分校正集、驗(yàn)證集樣品分別為46和23個(gè)，采用PLS法建立氟蟲(chóng)腈含量的定量模型。

進(jìn)行模型優(yōu)化，對(duì)光譜進(jìn)行基線(xiàn)校正處理，得到光譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，基線(xiàn)校正顯著消除了基線(xiàn)處的部分噪聲干擾。采用4種預(yù)處理方法（平滑去噪、Savitzky-Golay導(dǎo)數(shù)、SNV、MSC）結(jié)合3種變量選擇算法（iPLS、MWPLS、ICO）優(yōu)化模型，得到最優(yōu)模型為MSC預(yù)處理結(jié)合ICO方法選擇的變量建立的模型，其參數(shù)為：R2=0.9762，RMSECV=0.0017，RMSEP=0.0022（模型參數(shù)見(jiàn)表1）。ICO選擇的變量見(jiàn)圖3，選擇了波數(shù)在（a）3920～3830 cm?1、（b）3750～3580 cm?1、（c）2238～2165 cm?1、（d）1389～1310 cm?1、（e）1140～1070 cm?1和（f）908～813 cm?1的區(qū)域，其中： （a）和（b）兩區(qū)域無(wú)明顯吸收;（c）區(qū)域在2170 cm?1處有一個(gè)明顯吸收峰，是氟蟲(chóng)腈的CN結(jié)構(gòu)信息，峰高隨氟蟲(chóng)腈含量變化明顯;（d）和（e）兩區(qū)域的多組峰包含了氟蟲(chóng)腈NCN結(jié)構(gòu)的振動(dòng)信息，且峰高隨氟蟲(chóng)腈含量變化明顯;（f）區(qū)域包含氟蟲(chóng)腈四取代苯環(huán)骨架的特征吸收，其峰高隨氟蟲(chóng)腈含量變化明顯，以上4個(gè)區(qū)域選擇的光譜范圍見(jiàn)圖4。模型的預(yù)測(cè)值與化學(xué)值相關(guān)關(guān)系圖見(jiàn)圖5，優(yōu)化后的模型對(duì)樣品的預(yù)測(cè)效果更好。

3.3?固體樣品中氟蟲(chóng)腈定量模型的驗(yàn)證

將KS采樣法選擇出的23個(gè)樣品作為驗(yàn)證集，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，對(duì)于含量在0.10%～5.00%的樣品，預(yù)測(cè)結(jié)果的相對(duì)誤差均低于0.58;具體而言，對(duì)含量在0.10%～0.60%的樣品預(yù)測(cè)誤差較大，預(yù)測(cè)平均相對(duì)誤差（MRE）為0.37;對(duì)含量在0.60%～5.00%的樣品預(yù)測(cè)效果較好，MRE為0.10。

3.4?萃取液中氟蟲(chóng)腈最優(yōu)定量模型的建立及驗(yàn)證

為進(jìn)一步優(yōu)化3.2節(jié)建立的定量模型，考慮到啶蟲(chóng)脒制劑固體基質(zhì)較為復(fù)雜，且不同固體制劑的基質(zhì)各不相同，對(duì)有效成分低的樣品測(cè)定干擾較大，適用范圍有限。因此，用溶劑DMF萃取固體樣品中的氟蟲(chóng)腈并采集光譜，以氟蟲(chóng)腈在啶蟲(chóng)脒制劑中的含量為分析指標(biāo)建立模型：對(duì)光譜進(jìn)行基線(xiàn)校正（見(jiàn)圖2），顯著消除了液體樣品在基線(xiàn)處的噪聲;采用4種預(yù)處理方法（平滑去噪，Savitzky-Golay導(dǎo)數(shù)，SNV，MSC）結(jié)合3種變量選擇算法（iPLS，MWPLS，ICO）優(yōu)化模型。

得到最優(yōu)模型為SNV預(yù)處理結(jié)合MWPLS方法選擇的變量建立的模型，其參數(shù)為：R2=0.9810，RMSECV=0.0016，RMSEP=0.0019（模型參數(shù)見(jiàn)表1）。MWPLS選擇的變量見(jiàn)圖3，選擇了波數(shù)在（g）. 1335～1300 cm?1范圍的區(qū)域，該區(qū)域光譜見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，區(qū)域內(nèi)1315 cm?1處有一個(gè)吸收峰，峰高隨氟蟲(chóng)腈含量變化明顯，代表了氟蟲(chóng)腈N-C-N的振動(dòng)。模型的預(yù)測(cè)值與化學(xué)值的相關(guān)關(guān)系圖見(jiàn)圖5，可見(jiàn)萃取液建立的模型對(duì)樣品的預(yù)測(cè)效果最優(yōu)。

將KS采樣法選擇出的23個(gè)樣品作為驗(yàn)證集，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)于含量在0.10%～5.00%的樣品，預(yù)測(cè)結(jié)果的相對(duì)誤差均低于0.78;具體而言，對(duì)含量在0.10%～0.60%的樣品預(yù)測(cè)誤差較大，MRE為0.49;對(duì)含量在0.60%～5.00%的樣品預(yù)測(cè)效果較好，MRE為0.08。與固體樣品模型的預(yù)測(cè)能力相比，對(duì)于低含量（0.10%～0.60%）樣品的預(yù)測(cè)能力較差，可能是由于低含量樣品含量過(guò)低，稱(chēng)量及萃取過(guò)程中存在較大誤差，且紅外吸收受萃取溶液溶劑峰的影響過(guò)大;對(duì)于較高含量（0.60%～5.00%）樣品的預(yù)測(cè)能力有較大提高，預(yù)測(cè)更穩(wěn)定。

4?結(jié) 論

本研究測(cè)定了固體農(nóng)藥制劑中氟蟲(chóng)腈的含量及其經(jīng)萃取后液體樣品中的氟蟲(chóng)腈含量，得到的模型對(duì)氟蟲(chóng)腈含量在0.60%～5.00%的啶蟲(chóng)脒商品制劑含量預(yù)測(cè)效果較好，MRE為0.08，在《農(nóng)藥制劑產(chǎn)品中微量其他農(nóng)藥成分限量》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)[20]允許的含量（<5%）范圍內(nèi)，能滿(mǎn)足實(shí)際農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)管中氟蟲(chóng)腈的分析要求，為固體農(nóng)藥混合制劑中有效成分的檢出提供了理論基礎(chǔ)，但對(duì)于低含量樣品（0.10%～0.60%）有效成分的快速準(zhǔn)確檢測(cè)仍需進(jìn)一步的探索。

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