點擊化學反應在蛋白質(zhì)組學分析中的研究進展

占方玲 高思宇 謝元棟 張金銘 李毅 劉寧

摘?要?一價銅催化的疊氮炔基的特異性反應通常被稱為“點擊化學反應”。點擊化學反應作為一種重要的分子連接方式，能夠在分子水平實現(xiàn)特定小分子基團之間的簡單高效連接。因其快速高效、選擇性高、條件溫和、副反應少等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)組學分析中有廣泛應用，包括新生成蛋白的鑒定和多種翻譯后修飾蛋白的鑒定等方面。因此，深入研究點擊化學反應在蛋白質(zhì)組學中的反應機制，對理解蛋白質(zhì)的結(jié)構功能具有重要意義。本文綜述了近年來點擊化學反應在蛋白質(zhì)組學中的幾類重要應用，并對其未來的發(fā)展趨勢進行了展望。

關鍵詞?點擊化學反應;蛋白質(zhì)組學;評述

1?引 言

蛋白質(zhì)組（Proteome）源于蛋白質(zhì)（Protein）與基因組（Genome）兩個詞的組合，這個概念最早是由澳大利亞Macquarie大學Wilkins等[1]提出。蛋白質(zhì)組學研究的主要內(nèi)容包括在蛋白質(zhì)水平上大規(guī)模地分析組織細胞的蛋白質(zhì)表達水平、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間的相互作用等，從而揭示蛋白質(zhì)的功能，已在疫苗篩選、指導治療、臨床藥物開發(fā)及預后判斷等領域發(fā)揮了重要作用[2，3]。

近年來，化學蛋白質(zhì)組學在化學生物學領域發(fā)展迅速，其利用合成化學方法生成小分子探針，揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構和功能。傳統(tǒng)的蛋白標記探針主要有生物素、熒光基團等，但普遍存在降低蛋白質(zhì)活性、對極性變化不夠敏感等缺點[4，5]。點擊化學的出現(xiàn)極大地降低了因探針摻入對蛋白活性的影響。點擊化學是指通過小分子基團的拼接，簡單高效地完成C-X-C雜原子化學合成的一類組合化學方法。目前，常用的點擊化學反應主要包括銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應（Copper-catalysed azide-alkyne cycloaddi-tion reaction，CuAAC）、直接促進的疊氮-炔基環(huán)加成反應（Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC）、逆電子需求的 Diels-Alder反應（Inverse electron demand Diels-Alder reaction，IEDDA）和施陶丁格鏈接反應（Staudinger ligation）4類[6]。其中，CuAAC是較為經(jīng)典的點擊化學反應，該反應是指由Cu+催化疊氮化合物與炔基化合物，生成三唑五元環(huán)化合物的共價加成反應，如圖1所示。該方法反應效率高，副反應少，反應條件溫和，具有很高的化學選擇性且不受水氧干擾、環(huán)境污染小等優(yōu)點[6]。近年來，點擊化學反應與基于質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)組學研究方法的結(jié)合在生物學領域廣泛應用，特別是為新生成蛋白[7]、棕櫚酰化修飾蛋白[8]、糖基化修飾蛋白[9]及磷酸化修飾蛋白的檢測提供了方法，在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用[10]、microRNA生物合成[11]和microRNA前體與蛋白質(zhì)相互作用[12]方面也有廣泛應用。點擊化學的使用對探索蛋白質(zhì)生物學起到了巨大的推動作用。本文對基于點擊化學反應在蛋白質(zhì)組學研究中的幾類重要生物學應用進展進行了綜述。

2?新生成蛋白的檢測

蛋白質(zhì)的合成是一個動態(tài)過程，在正常和病理條件下，細胞會通過產(chǎn)生新生成蛋白對環(huán)境變化做出反應，準確檢測蛋白質(zhì)對環(huán)境擾動所做出的反應對理解其潛在作用機制具有十分重要的意義。新舊蛋白質(zhì)共享相同的氨基酸庫，在生物學上難以區(qū)分，因此有必要對新生成蛋白進行特殊標記以進行定性與定量分析。傳統(tǒng)標記方法使用穩(wěn)定同位素氨基酸標記法（Stable isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC） [13]比較擾動前后蛋白質(zhì)的表達變化。相較于極高豐度的原有蛋白質(zhì)，新生成蛋白質(zhì)常因豐度太低，無法實現(xiàn)在大多數(shù)質(zhì)量分析儀的定量動態(tài)范圍內(nèi)的檢測[14]，因此SILAC對于測量蛋白質(zhì)合成的短時段內(nèi)變化并不是最佳的方法。已有研究發(fā)現(xiàn)了兩種非天然氨基酸疊氮高丙氨酸（Azidohomoalanine，AHA）和高炔丙基甘氨酸（Homopropargylglycine，HPG），它們可以在細胞的正常蛋白質(zhì)合成時摻入到該蛋白的一級結(jié)構中，并且無明顯細胞毒性[15，16]。生物正交非天然氨基酸標記法（Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging，BONCAT，如圖2所示[17]）利用此特點，通過代謝標記引入AHA或HPG[18，19]這種小分子基團甲硫氨酸類似物。將被標記的細胞進行裂解后，通過點擊化學反應將帶有炔或疊氮化物的親和標簽共價連接在目的蛋白上，再經(jīng)過親和素瓊脂糖凝珠對目的蛋白進行純化富集，最后將富集產(chǎn)物酶解成多肽，利用高通量質(zhì)譜進行分析檢測。該方法具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點[20，21]，可以選擇性富集新生成蛋白，實現(xiàn)對新生成蛋白更深入的分析，從而促進細胞間相互作用的生物學的研究發(fā)展。

該方法自建立以來，在動態(tài)蛋白質(zhì)組學的分析中得到廣泛應用。Shen等[22]采用Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging （BONCAT）與MS聯(lián)用技術對哺乳動物細胞進行了研究，發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個新生成蛋白在視覺條件時視神經(jīng)支配區(qū)急劇增加;作者進一步發(fā)現(xiàn)，Rab3家族成員中的突觸蛋白Rab3a、Rab3b和Rab3c受到視覺神經(jīng)的差異調(diào)節(jié)，在視覺刺激的頂蓋腦中Rab3b和Rab3c的表達量顯著增加，而Rab3a顯著減少，說明Rab3家族成員可能在體內(nèi)介導視覺依賴的行為可塑性中扮演不同的角色。Howden等[23]利用AHA標記并結(jié)合了SILAC的方法（Quantitative non-canonical amino acid tagging，QuaNCAT），只需要標記細胞數(shù)小時或喂食/注入動物1～4天，即可實現(xiàn)對低豐度新生成蛋白的定量分析。在該研究中，利用重同位素標記的氨基酸對T細胞刺激后分泌的新生成蛋白進行標記，隨后通過親和素微珠對目的蛋白進行富集，最后利用MS對新生成蛋白進行了定量檢測。Ma等[24]的方法更簡單直接，使用重同位素標記的AHA（Heavy isotope-labeled azidohomoalanine quantification，HILAQ）進行新生成蛋白的標記，再通過點擊反應添加生物素，接著對標記的蛋白進行沉淀洗滌和消化。該研究組對HT22細胞氧化模型的新生成蛋白進行了定量檢測，發(fā)現(xiàn)226種蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生了兩倍的變化，108種蛋白質(zhì)在細胞死亡途徑中得到富集，證明了HT22細胞作為一種分子工具，在研究神經(jīng)退行性疾病涉及的細胞凋亡的過程中十分有效。他們還將HILAQ法與QuaNCAT法進行比較發(fā)現(xiàn)，HILAQ使用肽水平富集，已被證明是比QuaNCAT中使用蛋白質(zhì)水平富集的更靈敏的方法，且HILAQ法定量的新生成蛋白是QuaNCAT法定量的3.5倍以上。綜上，HILAQ方法是一種新型的新生成蛋白的定量檢測方法，通過使用重同位素的標記簡化了新合成蛋白質(zhì)組的分析過程，并且具有更高的靈敏度。崔秀雲(yún)等[25]首先利用脂多糖刺激Raw264.7細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α，然后通過代謝摻入AHA，并利用點擊化學反應，使細胞中的新生成的蛋白標記上生物素標簽，再利用抗體對標記蛋白進行特異性捕獲，從而達到檢測特定的新生成蛋白的目的。該研究為檢測特定的微量新生成蛋白提供了一種可借鑒的方法。

除了上述AHA或HPG，一種非天然氨基酸對-疊氮-L-苯丙氨酸（p-azido-L-phenylalanine，azF）也被用于蛋白質(zhì)的代謝標記[26，27]。Smits等[28]開發(fā)了一種Click-MS的新型檢測方法，利用琥珀抑制技術選擇性地將琥珀終止密碼子（UAG）摻入到目的蛋白中，同時添加特定的tRNA和酰氨基-tRNA合成酶（aa-RS）。然后，通過無銅點擊化學反應對摻入對-疊氮-L-苯丙氨酸的目的蛋白進行特異性捕獲，最后利用質(zhì)譜檢測，實現(xiàn)單個目的蛋白的選擇性富集。研究者利用此方法，從哺乳動物細胞粗提取物中特異性富集了兩種目標蛋白： 信號轉(zhuǎn)錄與激活因子1（STAT1）和甲基CpG結(jié)合域蛋白3（MBD3）。與使用AHA或HPG的蛋白質(zhì)標記策略有所不同，該方法實現(xiàn)了對單個目的蛋白的特異性富集，對于揭示特定目標蛋白的代謝情況以及與其它蛋白間的相互作用具有重要意義。

3?翻譯后修飾蛋白的檢測

3.1?棕櫚酰化修飾蛋白的檢測

棕櫚?；揎椀鞍椎膫鹘y(tǒng)檢測方法是?；锼刂脫Q法 （Acyl-biotinyl exchange，ABE）[29]。 ABE法是先用碘乙酰胺封閉蛋白質(zhì)半胱氨酸上的自由巰基，利用羥胺選擇性地切割蛋白質(zhì)半胱氨酸和脂肪酸修飾基團之間的硫酯鍵，再將帶有生物素的巰基特異性反應活性試劑與新產(chǎn)生的自由巰基反應，最后對目的蛋白S-棕櫚酰化修飾蛋白進行純化、富集和檢測。已有研究采用ABE法對生物樣本中的棕櫚酰化修飾蛋白進行了數(shù)量及修飾位點的鑒定分析[30，31]。盡管ABE法在檢測棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)方面有了很大進展，但由于羥胺切割的是硫酯鍵，而不是S-棕櫚?；揎椀奶禺愇稽c，其它對羥胺敏感的硫酯鍵蛋白也有可能被同時富集[32]，因此存在假陽性率高、靈敏度低、放射性強等缺點，極大限制了在棕櫚?；揎椀鞍讬z測方面的應用。

近年來，研究者發(fā)展了另一種蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀姆治龇椒ǎ?化學報告基團法（Chemical Reporter）[33]，該方法能夠區(qū)分S-脂肪酰化（棕櫚?；揎棧┑牡鞍缀蚇/O-脂肪?；牡鞍?。與上述ABE法不同的是，該方法將含有炔基的棕櫚酸類似物代謝摻入細胞蛋白質(zhì)，然后通過點擊化學方法，選擇性地將帶疊氮基團的生物素連接到標記了炔基探針的蛋白質(zhì)上，接著使用羥胺對棕櫚?；揎椀鞍椎牧蝓ユI處進行特異性切割，最后采用抗生物素瓊脂糖凝珠對蛋白質(zhì)進行富集和鑒定，從而實現(xiàn)對棕櫚?；揎椀鞍椎臋z測，如圖3所示。炔烴和疊氮化物脂肪酸探針通常都能有效標記細胞脂肪?；鞍踪|(zhì)，其中炔基探針因具有較低的背景信號及更高的檢測靈敏度和檢測效率等優(yōu)點應用更為廣泛[34]。同時，添加一個疊氮基團到脂肪酸鏈上可能會影響脂肪酸的疏水性，而炔基可保留脂肪酸碳鏈的疏水性，減少對脂肪酸物理化學性質(zhì)的改變及其與脂質(zhì)間的相互作用的影響[32]。Yount等[35]在吞噬細胞（鼠樹突狀細胞系）中使用Alk-C16進行大規(guī)模棕櫚?；笀D譜分析，鑒定出157種具有多種功能，包括先天免疫的S-棕櫚?；鞍祝ㄆ渲?0個高可信度蛋白和97個中可信度蛋白）。他們研究發(fā)現(xiàn)棕櫚?；瘜τ诟蓴_素誘導的跨膜蛋白（IFITM3）的抗病毒活性至關重要，該蛋白在其膜上3個近半胱氨酸殘基（Cys71/72/105）處被棕櫚?；?。此外，Teo等[36]將基于點擊化學的探針用于分析感染單純皰疹病毒（HSV）的宿主細胞中的整體脂肪?；?，發(fā)現(xiàn)宿主S棕櫚?；鞍椎囊粋€子集（包括干擾素和四跨膜蛋白家族成員）被選擇性抑制，在感染過程中，很大一部分HSV蛋白均被S-棕櫚?；?/p>

3.2?糖基化修飾蛋白的檢測

蛋白質(zhì)的糖基化修飾是一種重要且常見的翻譯后修飾，占人類蛋白質(zhì)總量的一半以上，該修飾方式參與許多生理功能和生物學途徑[37]。在許多疾病中都能觀察到糖基化修飾蛋白的異常，如自身免疫性疾病、心血管疾病、阿爾茲海默癥和癌癥等[38，39]，因此對生理病理條件下的糖基化修飾蛋白進行動態(tài)監(jiān)測對于理解疾病的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。

點擊化學介導的糖基化蛋白的標記（Glycoprotein labeling with click chemistry，GLCC）是一種常用檢測手段[40]。在這種方法中，含有生物正交功能基團（如疊氮）的單糖類似物通過細胞自身的代謝機制摻入細胞的聚糖中，再利用點擊化學反應將帶有生物素或熒光基團的炔基標記分子連接到糖基化蛋白上，最后通過鏈霉親和素瓊脂糖凝珠或熒光共聚焦顯微鏡成像對標記分子進行富集和檢測。目前，已有大量研究成功利用點擊化學反應對糖基化蛋白實現(xiàn)了可視化的動態(tài)檢測。Rong等[41]將疊氮作為化學報告基團，代謝摻入到大鼠心臟組織中，利用點擊化學反應在疊氮上連接帶熒光基團的炔基反應試劑，最后通過熒光共聚焦顯微鏡成像鑒定出超過200種唾液酸修飾的心肌蛋白如T-kininogens等，并對唾液酸化的聚糖和O連接的聚糖進行了高分辨率的成像分析，發(fā)現(xiàn)它們主要分布在細胞與細胞間的連接處和T型管的細胞膜上。該研究還證明，點擊化學反應介導的糖蛋白標記在細胞水平、獨立的心臟器官水平和多肽水平都能實現(xiàn)標記，并成功進行檢測（圖4）。其中，在細胞水平采用一價銅離子催化的點擊反應將代謝摻入的疊氮糖與炔基熒光488分子相連接，通過熒光共聚焦顯微鏡成像進行檢測;在獨立心臟器官水平，對標記了疊氮糖的心臟組織進行Langendorff灌注，考慮到銅離子的生物毒性，研究采用的是不依賴于銅的DBCO-熒光488基團標記代謝摻入的疊氮糖，并對完整的心臟進行熒光成像分析;在組織裂解液水平，將摻入了疊氮化物的心臟組織進行裂解后，與炔基生物素進行點擊反應，用鏈霉親和素富集唾液酸化的糖蛋白，然后進行凝膠水平的蛋白鑒定。這些實驗都證明了大鼠心臟糖原的體內(nèi)代謝標記可使完整心臟組織中的心肌細胞表面聚糖可視化，并發(fā)現(xiàn)在獨立器官水平的心肌肥大模型小鼠的病理過程中，唾液酸化聚糖的生物合成上調(diào)，證明唾液酸化對心臟發(fā)育和發(fā)病機制存在潛在影響。Herber等[42]采用點擊反應富集糖表面蛋白（Surface-spanning protein enrichment with click sugars，SUSPECS）方法，實現(xiàn)了細胞表面糖蛋白的富集、鑒定和定量分析。該研究先使用點擊化學反應選擇性標記細胞表面糖基化修飾蛋白，而后通過對生物素的檢測，對糖基化修飾蛋白進行高通量質(zhì)譜定量分析?；诿庖邿晒夤簿劢癸@微鏡顯示，SUSPECS選擇性標記了細胞表面蛋白，在原代神經(jīng)元表面存在近700種跨膜糖蛋白。他們還將該方法應用于治療阿爾茲海默病的關鍵藥物靶標蛋白酶BACE1的研究中，發(fā)現(xiàn)BACE1通過抑制酶代謝，選擇性重塑了神經(jīng)元表面糖蛋白組，這種將點擊化學反應與疾病關鍵藥物靶標蛋白檢測相結(jié)合的手段對揭示阿爾茲海默病的發(fā)病機制具有重要意義。Song等[43]將含疊氮的AC4ManNAZ代謝摻入到細胞膜表面，利用銅催化的點擊化學反應富集糖基化修飾蛋白，通過這種方式能夠去除豐度較高的胞質(zhì)蛋白，更好地表征細胞膜表面的糖基化修飾蛋白。Yang等[44]成功對前列腺癌細胞系中的唾液酸化糖蛋白進行了鑒定。在非轉(zhuǎn)移性N2細胞系中觀察到36種細胞表面的糖蛋白，其中有8種糖蛋白參與細胞凋亡過程;在轉(zhuǎn)移性ML2細胞系中發(fā)現(xiàn)44種細胞表面的糖蛋白，其中有11種糖蛋白與細胞運動、遷移和侵襲有關。在上述與細胞侵襲有關的糖蛋白中，有6種糖蛋白不論是轉(zhuǎn)移性還是非轉(zhuǎn)移性均可用作生物標記。該研究策略對前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程的研究起到了極大的推動作用。

目前，點擊化學反應不局限于疊氮和炔基的反應，還有一類新型的點擊化學反應——硫醇和烯的特異性反應[45]，在分子印跡技術標記糖蛋白方面發(fā)展迅速。首先，分子印跡是一種在模板分子存在下制備特異識別聚合物的技術，因具有成本低且易于制備的優(yōu)點，被成功應用于分子的分離和識別[46]。相比于以往熒光功能單體繁瑣的設計合成過程，新型分子印跡熒光傳感器的合成無需額外的熒光材料（量子點、碳點和熒光素等），只需通過簡單的點擊反應即可將普通的蛋白質(zhì)印跡聚合物轉(zhuǎn)變成一種新型的分子印跡熒光傳感材料，可應用于生物大分子（如蛋白質(zhì)和多肽）的識別。Zhao等[47]利用該結(jié)合技術，將普通分子印跡聚合物升級為生物傳感器熒光傳感材料，成功實現(xiàn)了糖蛋白的快速檢測。他們使用含有二硫鍵的功能單體，在二硫鍵斷裂后，將暴露的硫醇基團通過“硫醇-烯”的點擊反應連接上帶有熒光特性和位點特異性識別的功能基團。通過一步位點特異性反應，不僅引入了與糖蛋白具有親和力的官能團，還賦予了普通蛋白印跡聚合物良好的熒光特性（線性范圍為0.1～10 mg/mL），使普通蛋白印跡聚合物中功能基團的轉(zhuǎn)換更方便簡單。

3.3?磷酸化修飾蛋白的檢測

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是一種重要的翻譯后修飾，參與細胞的增殖分化、信號轉(zhuǎn)導、新陳代謝等生命活動過程，是生物體內(nèi)最重要的調(diào)節(jié)機制之一[48]。異常的磷酸化調(diào)節(jié)會導致許多嚴重的人類疾病[49]，對磷酸化修飾蛋白進行檢測分析有助于推進疾病發(fā)病機制的研究。目前，常用的磷酸化修飾蛋白分離富集方法主要包括三類： 免疫沉淀法、親和色譜法和化學衍生法[50]。

近年來，點擊化學反應在磷酸化修飾蛋白的檢測方面也發(fā)揮了巨大作用。Akiba等[51]發(fā)現(xiàn)了一種帶正電荷的雙核Tb絡合物Tb2-L，該絡合物僅在磷酸酪氨酸存在下明顯發(fā)光，可用于選擇性地檢測磷酸酪氨酸（pTyr）。然而，當多肽底物帶正電荷時，因存在靜電互斥作用，檢測靈敏度明顯降低。為克服此缺點，該研究組提出了一個更優(yōu)的方法，向Tb2-L分子中添加帶有炔基的基團，生成一種新型的絡合物探針Tb2-Lc1yne;同時，向磷酸化多肽底物的半胱氨酸殘基上引入一個疊氮基團，最后利用疊氮-炔基的點擊化學反應使絡合物探針與磷酸化的多肽底物實現(xiàn)共價結(jié)合。當多肽底物被磷酸化時，基于鑭系元素發(fā)光的信號會發(fā)生明顯改變，從而實現(xiàn)酶促酪氨酸磷酸化蛋白的動態(tài)監(jiān)測。在這項研究中，酪氨酸磷酸化肽段的信號可通過時間分辨光譜清晰地與背景區(qū)分開，易于進行詳細的定量分析。綜上，該方法利用點擊化學反應，只需將這種Tb絡合物添加到反應混合物中，即可實現(xiàn)對酪氨酸激酶的磷酸化和去磷酸化的實時監(jiān)控，是一種測定潛在蛋白激酶抑制劑的良好工具，對藥物開發(fā)的研究具有十分重要的推進作用。

4?展 望

近年來，將點擊化學反應與SILAC、BONCAT、分子印跡等方法相結(jié)合，為高通量質(zhì)譜法檢測蛋白質(zhì)提供了新思路。通過使用可發(fā)生點擊反應的探針，可對新生成蛋白和翻譯后修飾蛋白進行可視化研究，并實現(xiàn)蛋白質(zhì)組學的定性與定量檢測?？紤]到蛋白質(zhì)糖基化修飾和磷酸化修飾等翻譯后修飾在多種疾病中的關鍵作用，開發(fā)相應的蛋白特異性識別探針至關重要。目前，點擊化學反應僅在少數(shù)幾種類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中得到應用，利用點擊化學反應開發(fā)針對其它類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的特異性探針的研究將成為未來一個重要的研究方向。同時，對于蛋白質(zhì)標記而言，目前僅針對甲硫氨酸開發(fā)了可直接進行點擊反應的小分子類似物，而針對其它種類的氨基酸篩選出一系列相應類似物，將極大拓展點擊化學反應在蛋白質(zhì)動態(tài)分析中的廣泛應用。此外，銅催化的點擊化學反應會帶來一定的生物毒性，因此，開發(fā)無毒高效的體內(nèi)新型點擊反應仍然是未來點擊化學反應研究的一個熱點方向。

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