HPLC 法測定二益丸中阿魏酸和歐前胡素的含量

李 巖，李成明，張生萍，白賀明，姬良亮，劉興國

（1.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

二益丸是國家中藥保護品種，其處方由白芷、當(dāng)歸等22 味中藥加工制成；具調(diào)經(jīng)止帶，溫暖子宮之效；臨床用于經(jīng)脈不調(diào)，行經(jīng)腹痛，淤血癆癥，下元虛寒，腰膝酸痛，赤白帶下。二益丸收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第一冊》[1]，國家藥監(jiān)局網(wǎng)站顯示目前生產(chǎn)單位僅有蘭州佛慈制藥股份有限公司一家?，F(xiàn)行標準中通過顯微鑒別和丁香的薄層鑒別對藥品質(zhì)量進行控制，極為簡單，且處方中用量較大的當(dāng)歸、白芷無相適應(yīng)的檢測項目。此外，關(guān)于二益丸的文獻報道較少，劉貽珍等[2]通過薄層鑒別法對二益丸進行定性鑒別，同時采用HPLC 法測定了歐前胡素的含量，但利用高效液相色譜法同時對阿魏酸和歐前胡素進行測定尚未見報道。因此，本研究在現(xiàn)行標準的基礎(chǔ)上，建立HPLC 法同時測定二益丸中當(dāng)歸和白芷的指標性成分阿魏酸和歐前胡素含量的方法，操作簡便、結(jié)果準確，為全面控制其質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器及試藥

E2695型高效液相色譜儀（美國Wters）；BSA224SCW 型萬分之一天平（德國賽多利斯），MS105DU 型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒）；SBL-10DT 型超聲清洗儀（寧波新芝生物科技）；超純水機（Millipore）。

阿魏酸對照品（111773-201614，純度：99.0%）和歐前胡素對照品（110826-201415，純度99.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純（默克），冰醋酸為分析純，水為超純水。二益丸：規(guī)格為4g/丸；制造商為蘭州佛慈制藥股份有限公司；批號分別為17H5、17H6、17H7、17H8、18A1、18A2、18A3、18A4、18A5、18F9。

2 方法與結(jié)果[3-6]

2.1 色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18 MGII 色譜柱（5μm，250×4.60mm）；流動相：以甲醇為流動相A，以0.4%醋酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫（見表1）；流速：1.0mL·min-1；紫外檢測器檢測，檢測波長：313nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL；理論塔板數(shù)按阿魏酸、歐前胡素峰計均不低于4000，分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照儲備溶液的制備

分別取阿魏酸和歐前胡素對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每lmL 含阿魏酸0.418968mg、歐前胡素0.1216948mg 的溶液。

表1 梯度洗脫時間

2.2.2 二益丸樣品溶液的制備

二益丸供試品，剪碎，混勻，取約4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-2%冰醋酸混合溶液20ml，密塞，稱重，加熱回流45min，放冷，稱重，用甲醇-2%冰醋酸混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液既得。

2.2.3 陰性對照溶液

按二益丸標識處方，取相應(yīng)藥材，適量配制缺當(dāng)歸、白芷藥材的陰性對照樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

取對照品儲備液適量，加甲醇配制成每1mL 分別含阿魏酸4.19、8.4、16.8、41.9、83.8、209.5ug 和歐前胡素6.08、12.2、24.3、60.8、121.7、243.4ug 的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。按外標兩點法，以峰面積為橫坐標，進樣量（μg）為縱坐標，繪制標準曲線，得阿魏酸線性方程為：Y=1.725571×104X+4.611193×104，r=0.999873，線性濃度范圍為4.19～209.5mg·mL-1；歐前胡素線性方程為：Y=2.049288×104X+2.183337×104，r=0.999949，線性濃度范圍為6.08～243.4mg·mL-1。

2.3.2 精密度試驗

精密量取每1mL 含阿魏酸16.8μg 和歐前胡素24.3μg 的混合對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次，計算得阿魏酸峰面積的RSD 為1.1%（n=6）、歐前胡素峰面積的RSD 為1.7%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取批號為17H5 的二益丸供試品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、4、8、12、16、24h 各進樣1 次，測定峰面積，計算得阿魏酸峰面積的RSD 為1.3%（n=6）、歐前胡素峰面積的RSD 為0.9%（n=6），表明在24h 內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

取批號為17H5 的二益丸供試品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，測得阿魏酸和歐前胡素的平均含量分別為1.3%和0.6%（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗

采取加樣回收方法，精密稱取批號為17H5 的二益丸樣品（其含量分別為：阿魏酸0.0313mg/g、歐前胡素0.1294mg/g）6 份，精密加入阿魏酸對照品和歐前胡素對照品適量，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，阿魏酸和歐前胡素的平均回收率分別為93.71%、96.96%，RSD 分別為1.22%、0.92%（n=6）。結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果（n=3）

2.4 樣品測定

取10 批次二益丸供試品按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，測定結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果（n=3）

2.5 陰性對照試驗

取“2.2.3”項下制備的陰性對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進行分析，結(jié)果顯示陰性對照樣品中在阿魏酸和歐前胡素對照品相應(yīng)位置處無干擾峰。相關(guān)HPLC 色譜圖如圖1 所示。

圖1 HPLC 色譜圖

3 討論

二益丸現(xiàn)行質(zhì)量標準極為簡單，僅有顯微鑒別和丁香的薄層鑒別，沒有含量測定項目，無法有效控制其質(zhì)量。本研究通過對處方中當(dāng)歸和白芷的前處理方法以及高效液相色譜條件的進行摸索、考察，確定了同時測定處方中當(dāng)歸和白芷的指標性成分阿魏酸和歐前胡素含量的檢驗方法。

首先，采用紫外分光光度法進行全波長掃描，阿魏酸和歐前胡素的最大吸收分別為321.0nm、300.0nm，兩者混合溶液的最大吸收為306nm；采用二極管陣列檢測器分別在300.0nm、310.0nm、311.0nm、312.0nm、313.0nm、314.0nm、315.0nm、316.0nm和321.0nm 處，按“2.1”項下色譜條件對阿魏酸和歐前胡素混合對照品溶液進行分析，結(jié)果表明在313.0nm 處各成分具有良好的紫外吸收，基線平穩(wěn)。

本研究考察了多種提取溶劑（甲醇、不同比例的甲醇與冰醋酸溶液體系）、多種提取方法（超聲、回流）及多個的提取時間（30、45、60、75、90min），通過摸索多個前處理因素對提取結(jié)果及效率的影響，最終根據(jù)實驗結(jié)果確定：以甲醇-2%冰醋酸混合溶液，加熱回流提取45min，提取率最高。

二益丸處方包含22 味中藥材，其化學(xué)組分復(fù)雜，采用HPLC 方法對其有效成分進行含量測定時，考慮到分離度因素，故采用梯度洗脫的色譜條件，通過大量實驗，不斷優(yōu)化，最終確定為以甲醇為流動相A，以0.4%醋酸溶液為流動相B 的梯度洗脫色譜條件。

本研究所述方法操作簡單，結(jié)果可靠，適宜于二益丸的質(zhì)量控制，為全面控制其質(zhì)量提供參考依據(jù)。