鈣鹽沉淀法從酮酸發(fā)酵液中提取α-酮戊二酸

彭小雨， 曾偉主， 周景文， 徐國強*

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122； 3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

α-酮戊二酸（α-KG）作為重要的二元羧酸，參與微生物體內(nèi)的碳氮代謝，并在整個碳氮代謝過程中起著至關(guān)重要的作用[1-2]；在食品、制藥、化學(xué)以及動物飼料等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用[3-4]。丙酮酸（PA）又稱2-氧代丙酸，是最重要的氧代羧酸之一[5-6]，參與細胞體內(nèi)的能量代謝，并在其中扮演著極其重要的角色。 目前，化學(xué)合成法因生產(chǎn)成本高，環(huán)境污染嚴重等缺點逐漸被無污染的生物發(fā)酵法所取代。 本實驗室在2010 年篩選出了一株以甘油為碳源并過量積累α-酮戊二酸的菌株（Yarrowia lipolytica WSHZ06），利用此菌株生產(chǎn)α-酮戊二酸，產(chǎn)量高達39.2 g/L，但是丙酮酸的產(chǎn)量卻高達16.8 g/L[7]。 為了能夠減少丙酮酸的積累，同時又能夠過量積累α-酮戊二酸，研究人員采取了代謝改造[8-9]和過程優(yōu)化[10-11]等策略來達到這一目標，但是丙酮酸積累的問題依然存在。 酮酸聯(lián)產(chǎn)為整個實驗提供了一個新的思路。在前期工作中本研究室對于發(fā)酵優(yōu)化聯(lián)產(chǎn)酮酸已經(jīng)達到很好的效果，α-酮戊二酸和丙酮酸的產(chǎn)量分別高達67.4 g/L 和39.1 g/L[12]。

由于α-酮戊二酸和丙酮酸的化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)較為相似，一般常用的分離提取方法無法將兩者進行有效的分離。 Pal 等對于反應(yīng)萃取法的研究比較多，先后采用了不同的單一萃取劑（磷酸三丁酯[13]，三辛胺[14]，三丁胺[15]）和混合萃取劑（磷酸三丁酯，三辛胺，季胺氯化物）來分離發(fā)酵液中的丙酮酸[16]。但是大量的有機溶劑的使用以及復(fù)雜的操作程序也限制該方法在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用。 在2013 年，占宏德等通過篩選多種不同類型的交換樹脂發(fā)現(xiàn)，D301 樹脂為分離α-酮戊二酸的最佳吸附樹脂，并且通過階段洗脫的策略，使α-酮戊二酸的收率達到了93.2%[17]。 李斌水等采用氯化鈣沉淀發(fā)酵液中的α-酮戊二酸[18]，但是發(fā)酵液中會出現(xiàn)大量游離的Cl-，Cl-對金屬容器腐蝕性較強且成本高，在工業(yè)上大規(guī)模應(yīng)用受到制約。 王東陽等采用氫氧化鈣來沉淀發(fā)酵液中的α-酮戊二酸[19]，氫氧化鈣和α-酮戊二酸沉淀結(jié)合較少，收率較低。而本文中主要對比了3 種不同鈣鹽（CaCl2，CaCO3和Ca（OH）2）對發(fā)酵液中酮酸的影響，最后建立一種有效分離發(fā)酵液的α-酮戊二酸的鈣鹽沉淀方法。 并對分離提取過程工藝進行了探索，希望能為酮酸的提取和純化提供理論參考。

1材料與方法

1.1 試劑與儀器

丙酮酸和α-酮戊二酸標品，購于上海國藥集團有限公司；濃硫酸、CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2等均為國產(chǎn)分析試劑。 酮酸發(fā)酵液：由本實驗室發(fā)酵所得（菌株：Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3），含有44.68 g/L的α-酮戊二酸和36.93 g/L 的丙酮酸。

恒溫培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械研究所產(chǎn)品；恒溫搖床： 上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；15 L 發(fā)酵罐：迪必爾生物工程有限公司產(chǎn)品；臺式高速離心機：德國艾本德公司產(chǎn)品；pH 計：瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；Agilent 1260 高效液相色譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液的預(yù)處理 根據(jù)Zhou 的發(fā)酵方法[7]，利用解脂亞洛酵母WSH-Z06 C3 發(fā)酵生產(chǎn)酮酸，待發(fā)酵結(jié)束后， 將酮酸發(fā)酵液在8000 g 的條件下離心20 min，去除沉淀物，收集上清液。 然后通過納濾膜儀器除去上清液中的大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量（＞500），如蛋白質(zhì)、色素。 備用。

1.2.2 鈣鹽沉淀法分離α-酮戊二酸 配制50 g/L的α-酮戊二酸標準溶液， 取50 mL α-酮戊二酸水溶液，加入等摩爾質(zhì)量的鈣鹽固體。 待固體完全溶解后，用質(zhì)量分數(shù)為50%的Ca（OH）2緩慢調(diào)節(jié)pH至3 個梯度：6.0、6.5 和7.0。沸水浴加熱至上清液澄清（15 min），抽濾，量取濾液體積，高相液相色譜法（HPLC）檢測濾液中α-酮戊二酸的含量。

1.2.3 鈣鹽沉淀法分離丙酮酸 配制50 g/L 的丙酮酸標準溶液，取50 mL 丙酮酸水溶液，加入等摩爾質(zhì)量的鈣鹽固體。 待固體完全溶解后，緩慢加入質(zhì)量分數(shù)為50%的Ca（OH）2使溶液的pH 在6.0～7.0之間。 沸水浴加熱至上清液澄清（15 min），抽濾，量取濾液體積，HPLC 檢測濾液中α-酮戊二酸的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)計算方法

式中：R1，樣品的最終回收率，%；m1，烘干后的鈣鹽沉淀質(zhì)量，g；ρ， 初始酮酸質(zhì)量濃度，g/L；V， 初始體積，mL；P2，樣品的最終純度，%；F標樣，HPLC 檢測標樣峰面積；F試樣，HPLC 檢測試樣峰面積；m標樣，標樣質(zhì)量，g；m試樣，試樣質(zhì)量，g。

1.2.5 HPLC 分析 取1 mL 濾液于8000 g 離心5 min， 將上清液稀釋適當?shù)谋稊?shù)， 然后經(jīng)0.22 μL水系濾膜過濾后，進行高效液相色譜分析。 色譜分析條件根據(jù)參考文獻[7]。

1.2.6 鈣鹽的檢測 取6 管5 mL 發(fā)酵液離心，去除上清液。 將離心后的菌體水洗2 次后， 向其中3管中加入2 mL 2 mol/L HCl， 另外3 管中加入等體積的水，充分混勻后，離心取上清液。 HPLC 檢測上清液中α-酮戊二酸的含量。

2結(jié)果與討論

2.1 鈣鹽沉淀法分離α-酮戊二酸

2.1.1 不同鈣鹽沉淀對α-酮戊二酸分離的影響分別以CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2為沉淀劑，考察了在3 個pH 梯度（6.0、6.5、7.0）下α-酮戊二酸的回收率，結(jié)果如表1 所示。 由表1 可知，以CaCl2為沉淀劑時，隨著pH 值的增加，濾液中的α-酮戊二酸呈下降趨勢， 但是α-酮戊二酸的回收率呈上升趨勢。在pH 6.5 時，α-酮戊二酸的收率達到最高，為98.05%。故選用6.5 作為CaCl2沉淀的pH。以CaCO3為沉淀劑時，α-酮戊二酸的收率并不是隨著pH 值的上升而呈上升趨勢。 在pH 6.5 時，α-酮戊二酸的收率達到最高， 為96.84%。 故選用6.5 作為CaCO3沉淀的pH。 以Ca（OH）2為沉淀劑時，Ca（OH）2沉淀時pH 影響不大， 在pH 7.0 時，α-酮戊二酸的收率達到最高，為96.58%。 故選用7.0 作為Ca（OH）2沉淀的pH。

表1 不同鈣鹽的沉淀結(jié)果Table 1 Precipitation capacity of different calcium salts

2.1.2 α-酮戊二酸鈣鹽酸化過程參數(shù)的確定 量取200 mL 水， 然后加入不同質(zhì)量的α-酮戊二酸固體，使α-酮戊二酸的濃度分別為50、100、150、200 g/L。表2 所示顯示了不同質(zhì)量濃度下所對應(yīng)的α-酮戊二酸的pH。 如表2 可明顯的觀察到，溶液中有機酸的質(zhì)量濃度和有機酸的pH 呈正相關(guān)。 當質(zhì)量濃度均達到300 g/L 時，此時溶液pH 為0.93，故酸化α-酮戊二酸鈣沉淀過程中可以盡可能提高α-酮戊二酸質(zhì)量濃度。 但為了完全地置換出α-酮戊二酸，溶液pH 應(yīng)該調(diào)節(jié)至低于該質(zhì)量濃度α-酮戊二酸的實際pH 值。 溶解沉淀物時加入水的體積為酮戊二酸鈣濕重的1～1.5 倍。

表2 不同質(zhì)量濃度有機酸的pH （25 ℃）Table 2 pH values of different organic acid concentrations（25 ℃）

2.1.3 α-酮戊二酸鈣鹽的純化 前期實驗已經(jīng)探索了3 種不同的鈣鹽沉淀法對α-酮戊二酸的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaCl2對α-酮戊二酸沉淀效果最好，收率接近98%。然而向發(fā)酵液中加入CaCl2后，發(fā)酵液中會出現(xiàn)大量游離的Cl-，Cl-對金屬容器腐蝕性較強且成本高，在工業(yè)上大規(guī)模應(yīng)用受到制約。 考慮到CaCO3和Ca（OH）2的沉淀效果相差不大，繼續(xù)考察CaCO3和Ca（OH）22 種鈣鹽的純化效果。

在高質(zhì)量濃度α-酮戊二酸條件下，應(yīng)用CaCO3和Ca（OH）2都會使溶液呈糊狀，α-酮戊二酸在質(zhì)量濃度為150 g/L 左右時已十分濃稠，α-酮戊二酸經(jīng)過CaCO3和Ca（OH）2沉淀和酸化后的得率分別為84.52%和85.19%。 兩者沉淀出的酮戊二酸鈣固體顏色不同，CaCO3沉淀出的固體為白色，Ca（OH）2沉淀出的為淡黃色。 酸化后溶液顏色如圖1 所示，應(yīng)用Ca（OH）2進行沉淀處理后的α-酮戊二酸溶液顏色深， 應(yīng)用CaCO3進行沉淀處理后的α-酮戊二酸溶液顏色較淺。 HPLC 檢測結(jié)果如圖2 所示，酸化后的溶液，α-酮戊二酸純度分別為：99.18%（CaCO3）和96.78% （Ca（OH）2），結(jié)果表明CaCO3是更適合沉淀α-酮戊二酸的鈣鹽。

圖1 標液沉淀后過濾圖Fig. 1 Graph of α-ketoglutaric acid model solution after precipitation

圖2 標液沉淀后過濾液HPLC 檢測Fig. 2 HPLC chromatogram of α-ketoglutaric acid model solution after precipitation

以CaCO3為沉淀劑，按照標液沉淀分離純化的過程來驗證分離發(fā)酵液中α-酮戊二酸。結(jié)果顯示α-酮戊二酸的收率和純度分別為82.5%和98.89%。 說明鈣鹽沉淀法適用于分離發(fā)酵液中的α-酮戊二酸。

2.2 鈣鹽沉淀法分離丙酮酸

分別以CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2為沉淀劑，考察了在pH 6.5 丙酮酸的沉淀效果， 結(jié)果如圖3 所示。 由圖3 可知，丙酮酸溶液澄清透明，說明鈣鹽沉淀法不適用于丙酮酸的分離提取。

圖3 丙酮酸沉淀結(jié)果Fig. 3 Graph of pyruvic acid model solution after precipitation

2.3 鈣鹽沉淀法分離發(fā)酵液中酮酸

鈣鹽沉淀法可較好沉淀分離α-酮戊二酸，而無法沉淀丙酮酸，考察該方法是否可用于聯(lián)產(chǎn)酮酸的分離。取50 mL 預(yù)處理后的發(fā)酵液，緩慢加入CaCO3固體，調(diào)節(jié)pH 至6.5，煮沸20 min，過濾，HPLC 檢測過濾液中有機酸的含量。結(jié)果表明α-酮戊二酸的收率為93.42%，但過濾液中丙酮酸相對含量明顯降低，并存在大量的雜質(zhì)。 如圖4 所示。

由于丙酮酸穩(wěn)定性差， 沉淀過程中的高溫、偏中性條件可能對丙酮酸有影響，故對這2 個因素進行驗證試驗。

圖4 發(fā)酵液沉淀后過濾液HPLC 檢測Fig. 4 HPLC chromatogram of fermentation broth after precipitation

2.4 丙酮酸穩(wěn)定性分析

2.4.1 溫度的影響 配制50 g/L 的丙酮酸的標準溶液，分別取10 mL 于試管中，加入一定量碳酸鈣，Ca（OH）2調(diào)節(jié)pH 至6.5，分別置于0、20、30、40、60、80、90 ℃條件下20 min。上清液稀釋50 倍后，HPLC檢測丙酮酸相對含量（峰面積表示）。 結(jié)果如圖5 所示。 由圖5 可知，在0～90 ℃之間，隨著溫度的升高，丙酮酸的峰面積有所下降，但是效果不明顯，所以說溫度對丙酮酸的穩(wěn)定性有較小的影響。

圖5 溫度對丙酮酸的穩(wěn)定性F ig. 5 Effect of temperature on the stability of pyruvic acid

2.4.2 pH 的影響 配制50 g/L 的丙酮酸標準溶液，分別取10 mL 于試管中，以CaCO3為鈣鹽沉淀劑，配制5 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.5。將過濾后的上清液稀釋50 倍，然后用HPLC 檢測溶液中的丙酮酸相對含量（峰面積表示），結(jié)果如圖6 所示。 由圖6 可知，向丙酮酸溶液中加入CaCO3對丙酮酸成分的影響較小，但是將pH 調(diào)至6.5 時，丙酮酸的峰面積顯著下降，并且周圍雜峰的峰面積開始顯著增加，這說明在pH 6.5 時可能導(dǎo)致丙酮酸發(fā)生聚合或者其他反應(yīng)。當在90 ℃處理20 min 時，丙酮酸的峰面積也下降了，但是沒有pH 對丙酮酸的作用強。

3結(jié) 語

圖6 pH 對丙酮酸的影響Fig. 6 Effect of pH on PA

丙酮酸是解脂亞洛酵母生產(chǎn)α-酮戊二酸的主要副產(chǎn)物，發(fā)酵過程中若在以Ca（OH）2維持較低的pH 值，發(fā)酵過程會積累大量的丙酮酸，而Ca2+有利于丙酮酸的積累；若以NaOH 調(diào)節(jié)pH，提取過程中酮戊二酸鈣的回收效率低。并且在α-酮戊二酸提取過程中，在偏中性pH 和高溫作用下，α-酮戊二酸的穩(wěn)定性不受影響，丙酮酸卻容易發(fā)生反應(yīng)生成大量雜質(zhì)， 且pH 對丙酮酸穩(wěn)定性的影響大于溫度對它的影響。 因此，當發(fā)酵液中含有較高濃度的副產(chǎn)物丙酮酸時，鈣鹽沉淀方法僅能提取純化出α-酮戊二酸，無法同時獲得高濃度的副產(chǎn)物丙酮酸，這將降低α-酮戊二酸的整個工業(yè)生產(chǎn)效益。 后期可以通過代謝改造使解脂亞洛酵母發(fā)酵高產(chǎn)α-酮戊二酸，而減少丙酮酸的積累， 然后利用鈣鹽沉淀法分離發(fā)酵液中的α 酮戊二酸，這樣就能很大程度提高生產(chǎn)效益。