定點(diǎn)突變提高過(guò)氧化氫酶熱穩(wěn)定性和催化效率

MUGISHA Samson， 楊套偉， 徐美娟， 張 顯， ULIHO Alphonse，錢海峰， 王 立， 饒志明*

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無(wú)錫214122；3. 江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

過(guò)氧化氫酶（過(guò)氧化氫氧化還原酶，EC1.11.1.6）廣泛存在于好氧生物中，在動(dòng)植物、細(xì)菌、真菌、古生菌中。它通過(guò)歧化作用直接分解由活性氧ROS 產(chǎn)生的過(guò)氧化氫形成水和氧氣。其中，ROS 是由細(xì)胞正常生長(zhǎng)過(guò)程中線粒體電子傳遞所形成的。 然而，過(guò)多的ROS 和自由基會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化性損傷甚至死亡[1-3]。因此，在氧化還原不平衡時(shí)，過(guò)氧化氫酶通過(guò)催化過(guò)氧化氫分解起到了解毒作用[4]。 此外，過(guò)氧化氫酶廣泛應(yīng)用于食品加工、紡織和臨床檢測(cè)中[5-7]。

根據(jù)其功能特點(diǎn)， 過(guò)氧化氫酶被分為3 類: 含血紅素過(guò)氧化氫酶、 過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物雙功能酶以及含錳離子的過(guò)氧化氫酶[8-9]。 其中單功能的過(guò)氧化氫酶由于其商業(yè)價(jià)值而受到更多的關(guān)注。 目前，許多研究者致力于篩選不同微生物來(lái)源的過(guò)氧化氫酶，并進(jìn)行同源或異源表達(dá)，以適用于不同的用途[10-13]。蛋白質(zhì)工程策略已被廣泛應(yīng)用于提高靶蛋白的性能，其中基于結(jié)構(gòu)模擬和計(jì)算等理性設(shè)計(jì)的定點(diǎn)突變來(lái)改造蛋白的方法已被廣泛使用[14-18]。 研究報(bào)道了不同種類的酶通過(guò)定點(diǎn)突變成功的提高了其催化能力及熱穩(wěn)定性[18-19]，但是對(duì)過(guò)氧化氫酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造的報(bào)道卻較少[20-21]。

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）由于具有多種抗氧化酶，從而比其他微生物具有更好的抗氧化能力[22-23]。本研究中, 選擇B. pumilusML413 來(lái)源的過(guò)氧化氫酶作為研究對(duì)象。 另外，菌株枯草芽孢桿菌168 由于具有良好的分泌表達(dá)能力而被廣泛作為工業(yè)表達(dá)宿主[24-25]，同時(shí)也被用來(lái)作為過(guò)氧化氫酶的異源表達(dá)的宿主菌。 本研究采用枯草芽孢桿菌168作為過(guò)氧化氫酶表達(dá)宿主菌， 利用 PoPMuSiC algorithm 軟件計(jì)算并預(yù)測(cè)了B. pumilusML413 血紅素過(guò)氧化氫酶(KatX2)的活性中心潛在突變位點(diǎn)的折疊自由能，對(duì)該位點(diǎn)附近的氨基酸進(jìn)行一系列定點(diǎn)突變來(lái)提高該區(qū)域的疏水性，從而提高過(guò)氧化氫酶的熱穩(wěn)定性。

1材料與方法

1.1 菌株，質(zhì)粒和材料

B. pumilusML413 為本研究室保藏。E. coliJM109 和B. subtilis168 分別作為克隆和表達(dá)菌株。質(zhì)粒pMA5 和pMD18-T 分別作為表達(dá)和克隆載體。 PrimeSTARe 擴(kuò)增酶、ExTaq DNA 擴(kuò)增酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI 和MluI，購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 回收試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；HisTrapTMHP 純化柱，購(gòu)自美國(guó)通用醫(yī)療集團(tuán)；其他試劑均為商業(yè)化商品。

1.2 定點(diǎn)突變及重組菌株的構(gòu)建

以B. pumilusML 413 的DNA 為模板， 用引物KatX2 F 和KatX2 R（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到過(guò)氧化氫酶基因。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后與克隆載體pMD18-T 連接獲得重組質(zhì)粒pMD18T-KatX2.用BamHI 和MluI 對(duì)pMD18T-KatX2 和pMA5 分別進(jìn)行雙酶切， 純化后， 將得到的KatX2 和線性化的pMA5 進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒pMA5-KatX2, 隨后將該重組質(zhì)粒利用Spizizen 描述的方法轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌168 中[26]。 以重組質(zhì)粒pMA5-KatX2 為模板，用表1 所示的引物進(jìn)行重疊延生PCR 的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變[27]。 含突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌JM109 中并驗(yàn)證，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌168 中進(jìn)行表達(dá)， 以菌株B.subtilis168/pMA5-KatX2 作為對(duì)照。

表1 引物序列表Table 1 Nucleotide sequences of primers

1.3 培養(yǎng)條件

挑取單菌落于10 mL 含50 mg/L 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)后， 以10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于含50 mg/L 卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油47 g/L, NH4Cl 1.5 g/L, 玉米漿15 g/L，K2HPO42.7 g/L，KH2PO42.1 g/L，MgSO4·7H201.9 g/L，NaCl 5 g/L， 酵母粉35 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0025 g/L，pH 7.0)中培養(yǎng)54 h。 在4 ℃下，10000 g 離心20 min，離心后收集上清液，并用0.22 mm 濾膜過(guò)濾后備用。

1.4 過(guò)氧化氫酶的純化

為防止酶的降解，純化在4 ℃條件下進(jìn)行。 首先，用終體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇沉淀發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，10000 g 離心30 min 收集蛋白質(zhì)沉淀。接著，用磷酸鉀緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0）懸浮，并用該緩沖液透析12 h 以除去多余離子。最后，將收集的樣品用Ni2+親和色譜層析的方法，利用AKTA 蛋白純化儀（GE Healthcare，USA）進(jìn)行純化，流速0.5 mL/min，用binding buffer（0.02 mol/L Tris-HCl buffer, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.4）將粗酶液吸附至1mL HisTrapTMHP 純化柱上，并用0～0.5 mol/L 的咪唑梯度洗脫得到過(guò)氧化氫酶純酶。 用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[28]. 用SDS-PAGE 對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化情況進(jìn)行分析。

1.5 酶活測(cè)定

過(guò)氧化氫酶的酶活測(cè)定在37 ℃下進(jìn)行。 將100 μL 的酶溶液加入到3 mL 反應(yīng)液（50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），10 mmol/L H2O2）中，在240 nm測(cè)定60 s 內(nèi)吸光度的變化[29]。 酶活單位：在37 ℃下降解1 μmol 過(guò)氧化氫所需的酶量定義為1 個(gè)酶活單位。

1.6 過(guò)氧化氫酶酶學(xué)特性分析

1.6.1 過(guò)氧化氫酶動(dòng)力學(xué)參數(shù) 用pH 7.0、50 mmol/L PBS 緩沖液配置10～90 mmol/L 的過(guò)氧化氫底物溶液在37 ℃條件下測(cè)定酶活。 利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖計(jì)算得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km，Vmax及Kcat值。

1.6.2 pH 及溫度對(duì)酶的影響 在37 ℃下， 采用不同pH 的緩沖液中測(cè)定酶的最適pH。 最適pH 測(cè)定所用的緩沖液如下： 檸檬酸鈉緩沖液 （50 mmol/L,pH 4～6）, PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH 6～8）, Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8～10） 和 甘氨酸-NaOH 緩沖液（50 mmol/L，pH 10～13）. 在4 ℃下，將酶浸入不同pH 的緩沖液中靜置24 h 后測(cè)定剩余酶活，得出該酶的pH 穩(wěn)定性曲線。 在最適pH 條件下，在10～60 ℃之間測(cè)定最適反應(yīng)溫度。 將在不同溫度下置于不同時(shí)間, 冰上放置15 min 后測(cè)定剩余酶活，得出該酶的熱穩(wěn)定性曲線。

1.6.3 金屬離子的影響 將酶分別加入含有1 mmol/L不同的金屬離子（Ni2+、Mn2+、Zn2+, Mg2+、Cu2+、K+、Fe2+和Co2+） 的磷酸緩沖液（50 mmol/L, pH 7.0）10 min后測(cè)定酶活，以不添加金屬離子的磷酸緩沖液作為對(duì)照。

1.7 結(jié)構(gòu)建模

利用SWISS-MODEL protein modeling server（http://swissmodel. expasy.org/）， 以 短 小 芽 孢 桿 菌MTCCB6033 過(guò)氧化氫酶(PDB id: 4qol. PubMed id:25663126) 為模板進(jìn)行同源建模。 利用Discovery Studio Client 2.5 和PyMOL View 軟件來(lái)得到突變后的模型結(jié)構(gòu)并分析二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。 用PoPMuSiC-2.1 algorithm 工具來(lái)找尋可能提高熱穩(wěn)定性的突變位點(diǎn)，并計(jì)算其吉布斯自由能[30]。

2結(jié)果與討論

2.1 突變位點(diǎn)的選擇

在本實(shí)驗(yàn)中， 以短小芽孢桿菌MTCCB6033 過(guò)氧化氫酶蛋白質(zhì)(PDB id:4qol.PubMed id:25663126)結(jié)構(gòu)為模板， 構(gòu)建了野生型和突變株的3D 結(jié)構(gòu)。Swiss model 選擇的模板與同源建模得到的結(jié)構(gòu)有99.39% 的相似性。

KatX2 由4 個(gè)相同的亞基組成， 每個(gè)亞基有3個(gè)對(duì)催化起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基（His57、位于血紅素腔的Asn130 以及在保守區(qū)域的Asn130）[31]。利用PoPMuSiC-2.1 algorithm 工具預(yù)測(cè)了各個(gè)殘基突變后自由能的改變，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果，我們選擇了其中自由能最低的3 個(gè)突變株（K117V、K117I 和K117M 的折疊自由能分別為-2.23, -2.58 kcal/mol和-1.84 kcal/mol）進(jìn)行突變。同時(shí)考慮到位于活性中心附近α-螺旋的氨基酸殘基對(duì)酶的熱溫度性起到關(guān)鍵作用，并且苯丙氨酸對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)鍵作用[32]，因此我們將M177 突變成苯丙氨酸。 構(gòu)建4 個(gè)過(guò)氧化氫酶突變體，并在枯草芽孢桿菌168 中進(jìn)行表達(dá)。

2.2 過(guò)氧化氫酶的過(guò)表達(dá)和純化

通過(guò)SDS-PAGE 分析表明，B. subtilis 168/pMA5-KatX2 以及分別含有KatX2 突變體K117V、K117I、 K117M 和M177P 的重組菌均構(gòu)建成功。 純化后，SDS-PAGE 分析表明純化效果較好無(wú)雜質(zhì)蛋白條帶，氧化氫酶相對(duì)分子質(zhì)量大小為5.8×104（圖1）。 野生酶和突變株K117V、K117I、K117M、M177P的比酶活分別為27559、36297、33582、29896 U/mg和31024 U/mg。

表2 突變前后酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of the purified wild-type catalase (KatX2) and its mutants

圖1 野生型過(guò)氧化氫酶KatX2 及其突變株K117V、K117I、K117M 和M177P 純化后的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified wild-type KatX2 and its mutants K117V，K117I，K117M and M177P

2.3 過(guò)氧化氫酶突變體酶學(xué)特性分析

過(guò)氧化氫酶突變前后的酶學(xué)特性如表2 所示。將K117 分別突變?yōu)槭杷缘臍埢╒al、Ile 和Met）比酶活分別提高了31.7%、21.8%和8.48%，60 ℃的半衰期分別提高了38、23 min 和9 min。 K117V 和K117I 的kcat分別為319427 s-1和317185 s-1，比野生型展現(xiàn)出更高的催化效率。 根據(jù)結(jié)構(gòu)分析可知，117 位的賴氨酸突變?yōu)槭杷睦i氨酸后，會(huì)與92 位的苯丙氨酸形成2 個(gè)氫鍵的連接，并且與疏水性的93 位纈氨酸和119 位酪氨酸共同形成一個(gè)疏水性的孔道（圖2（b））。 疏水性的孔道與位于血紅素附近主孔道的催化殘基Asp110 和Asn130 相連接。之前的研究報(bào)道表明，活性位點(diǎn)附近的疏水性對(duì)酶的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用[33]，疏水區(qū)域由于能增強(qiáng)穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)樗鰪?qiáng)了α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)域之間的聯(lián)系，而這一點(diǎn)與作為底物結(jié)合位點(diǎn)的配體有關(guān)[31]。 因此117 位親水性的賴氨酸突變?yōu)槭杷缘睦i氨酸并在活性中心形成疏水區(qū)域是提高酶熱穩(wěn)定性的原因。 將Lys117 突變?yōu)槠渌杷被幔ó惲涟彼岷偷鞍彼幔?加強(qiáng)了與周圍Phe114、Ala115、Val116、Phe118 和Tyr119 的相互作用，使疏水區(qū)域更加穩(wěn)定， 從而提高了酶的催化效率和熱穩(wěn)定性。另外，將Met177 突變成脯氨酸，脯氨酸起著維持蛋白質(zhì)形狀和折疊的重要作用，從而提高蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性和催化效率[32]. 如圖2（c）和2（d）所示,Met177和突變株P(guān)177M 通過(guò)同樣的氫鍵與Trp180、Leu181 和Ser174 形成極性連接， 但是熱穩(wěn)定性和催化活性卻有所差異，這可能是由于脯氨酸殘基能提高構(gòu)象的穩(wěn)定性所導(dǎo)致的。

2.4 溫度、pH 和金屬離子對(duì)突變體的影響

突變后，最適催化溫度未發(fā)生改變，均為40 ℃（表3），這與B.pumilusB4W 來(lái)源的過(guò)氧化氫酶相同[22]。 該結(jié)果與此前報(bào)道的常溫微生物來(lái)源的過(guò)氧化氫酶在15～55 ℃相一致[34]。所有的突變株在40 ℃下均保持良好的熱穩(wěn)定性，在20 ℃下儲(chǔ)藏20 h，酶活能保留90%以上。 在60 ℃，酶活下降速度顯著加快，野生型在60 ℃下的半衰期為220 min（見(jiàn)圖3），突變體K117V 在60 ℃下的半衰期提高了38 min。

圖2 過(guò)氧化氫酶及其突變的結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structural model analysis of the wild-type KatX2 and its mutants

表3 突變前后過(guò)氧化氫酶酶學(xué)特性Table 3 Characterization and thermostability of the wild-type catalase (KatX2) and its mutants

圖360 ℃下野生型過(guò)氧化氫酶及其突變株熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermo-stability of the wild-type KatX2 and its mutants at 60°C.

此外， 作者研究了野生型和突變株的pH 穩(wěn)定性。 結(jié)果如圖4 所示，突變前后在pH 7 的條件下均較穩(wěn)定， 能保留95%的酶活。 突變株K117V 在pH 12 的條件下保留了67%的酶活，展現(xiàn)出比野生型更好的pH 穩(wěn)定性。其他突變株在pH 4.0～13.0 的條件下，pH 穩(wěn)定穩(wěn)定性與野生型相似。 作者同樣研究了金屬離子對(duì)突變后酶活的影響。 如圖5 所示，金屬離子對(duì)過(guò)氧化氫酶突變前后的影響基本一致。 Fe2+和Mg2+對(duì)酶活有促進(jìn)作用。 Co2+對(duì)酶活有一定的抑制作用， Cu2+對(duì)過(guò)氧化氫酶有較強(qiáng)的抑制作用，但與較野生型相比較，Cu2+突變株K117V 抑制性有所降低。

圖4 pH 對(duì)過(guò)氧化氫酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on enzyme stability of the wild-type KatX2 and its mutants

圖5 金屬離子對(duì)過(guò)氧化氫酶酶活的影響Fig.5 Effect of metal ions on the activities of wild-type KatX2 and its mutants

3結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)B. pumilusML413 血紅素過(guò)氧化氫酶K117 進(jìn)行定點(diǎn)改造，提高了過(guò)氧化氫酶的熱穩(wěn)定性和催化活力。 突變株K117V 在60 ℃的半衰期提高了38 min, 并且比酶活提高了31.7%， 其他的突變株在熱穩(wěn)定性和催化能力上也有所提高。 我們從酶分子結(jié)構(gòu)上對(duì)造成熱穩(wěn)定性和酶學(xué)特性提高的原因進(jìn)行了分析，疏水性氨基酸以及脯氨酸的引入是造成該變化的原因。 突變后的過(guò)氧化氫酶顯示出更好的適用范圍，具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力。