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    α-L-鼠李糖苷酶基因的重組表達及其應(yīng)用

    2020-05-18 07:03:48葉德曉李慧靈林育成鄧誠陳宏基周金林
    生物化工 2020年2期
    關(guān)鍵詞:畢赤橙皮糖苷酶

    葉德曉,李慧靈,林育成,鄧誠,陳宏基,周金林*

    (1.廣東金駿康生物技術(shù)有限公司,廣東佛山 528225;2.佛山匯騰生物技術(shù)有限公司,廣東佛山 528225)

    α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是一類糖苷水解酶,主要屬于GH13、GH28、GH78和GH106家族,能高效水解許多天然糖苷酶類化合物末端的鼠李糖基,如水解橙皮苷、柚皮苷、蘆丁和槲皮苷等天然黃酮類糖苷化合物為橙皮素單葡萄糖苷、普魯寧、異槲皮苷和槲皮素等。α-L-鼠李糖苷酶能應(yīng)用于食品業(yè)中柑桔類果汁的去苦、飲料風(fēng)味改善以及食品添加劑的生產(chǎn)等[1]。除了在食品領(lǐng)域的應(yīng)用,α-L-鼠李糖苷酶還能應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè),如用于生產(chǎn)藥物或者藥物中間體以及對藥物進行改性以提高藥效等[2]。

    橙皮苷在柑桔屬的果皮中含量豐富,而我國是柑桔屬果樹種植和產(chǎn)量的第一大國,因此提高其綜合利用率對增加產(chǎn)業(yè)附加值具有重大意義。橙皮苷溶解性極低,人體較難吸收,生物利用率低,表現(xiàn)出相對較弱的藥理作用。研究表明,黃酮類化合物脫掉部分糖苷或者全部糖苷后,能被小腸更好地地吸收,以此來提高黃酮類化合物在人體的生物利用率[3]。利用α-L-鼠李糖苷酶將橙皮苷水解為橙皮素單葡萄糖苷,改善其溶解性,提高其生物利用率,可以加大其在食品和醫(yī)藥行業(yè)的運用范圍;另外,橙皮素單葡萄糖苷在鼠李糖轉(zhuǎn)移酶的催化下生成新橙皮苷,新橙皮苷是合成天然甜味劑NHDC的關(guān)鍵中間體,在酸橙中含量低,提取工藝復(fù)雜,成本高。因此,選用低成本的橙皮苷通過α-L-鼠李糖苷酶和鼠李糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化得到新橙皮苷在合成NHDC的產(chǎn)業(yè)化上有重大價值。

    將來源于T.petrophila的TpdRha基因進行分子克隆和異源表達,探究其水解橙皮苷為橙皮素單葡萄糖苷的活性,為后續(xù)研究酶轉(zhuǎn)化新橙皮苷及NHDC奠定物質(zhì)基礎(chǔ),能產(chǎn)生較好的社會價值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    克隆宿主大腸桿菌Top10、表達宿主畢赤酵母GS115和畢赤酵母KM71H、表達載體pPIC9K均為實驗室保存。實驗所用酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、山梨醇、瓊脂粉、瓊脂糖、磷酸氫二鈉和檸檬酸鈉等試劑均為分析純,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;BIO-RAD MicroPulser 1652100型電轉(zhuǎn)儀,購自美國BIO-RAD公司;Agilent 1100型高效液相色譜,購自安捷倫科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 TpdRha序列分析

    由CAZy數(shù)據(jù)庫,獲知6個已鑒定3D結(jié)構(gòu)α-L-鼠李糖苷酶。在NCBI中獲知其氨基酸序列,利用Clustalx軟件進行氨基酸多重序列比對,再通過ESPript 3.0對比對結(jié)果進行渲染,最后用MEGA7軟件制作分子進化樹。

    1.2.2 TpdRha基因克隆

    根據(jù)TpdRha在NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的序列信息,利用密碼子偏好性進行優(yōu)化,依據(jù)優(yōu)化結(jié)果進行合成,將其克隆至pPIC9K載體上。提取質(zhì)粒pPIC9K-TpdRha,以質(zhì)粒為模板,通用引物AOX進行PCR反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,交由生工生物有限公司測序。

    1.2.3 異源表達

    利用SalⅠ酶線性化pPIC9K-TpdRha質(zhì)粒,回收后將其電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115和畢赤酵母KM71H中。經(jīng)過含G418的YPD培養(yǎng)基篩選,挑選單克隆裂解后以通用引物AOX進行PCR鑒定,將正確的陽性克隆命名為GS115-TpdRha和KM71H-TpdRha。

    接種菌株到Y(jié)PD培養(yǎng)基于30 ℃活化培養(yǎng),1%的接種量至BMGY培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)OD600到2~6。室溫離心,收集菌體,用BMMY重懸菌體,28 ℃誘導(dǎo)表達,每天加終濃度為0.5%的甲醇,維持誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)表達5 d,4 ℃離心,上清即為粗酶液。

    1.2.4 TpdRha酶解橙皮苷

    分別加入pH為4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、橙皮苷混勻,加入粗酶液到混合后的橙皮苷溶液中,60 ℃恒溫反應(yīng)4 h,加入等體積的乙酸乙酯抽提,取上層有機相,經(jīng)真空濃縮后,反應(yīng)產(chǎn)物溶解于甲醇中,結(jié)果用HPLC檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 序列分析

    檢索CAZy數(shù)據(jù)庫,TpdRha屬于GH78家族,具有876個氨基酸殘基和糖基化位點,無信號肽序列,包含4個超家族保守結(jié)構(gòu)域,其中Bac_rhamnosid_N可能與識別底物有關(guān),另3個保守結(jié)構(gòu)域與其生物活性相關(guān)。TpdRha與DtRha(ACI19983.1)序列同源性為46.25%;與SaRha78A(BAC68538.1)序列同源性為35.64%;與AtRha(AFH54529.1)序列同源性為31.86%;與RhaB(BAB62315.1)序列同源性為27.78%;與KoRha(AEX05711.1)序列同源性為24.52%;與BtRha(AAO76108.1)序列同源性為20.76%。多重序列比對結(jié)果顯示Asp456、Trp466、Gly468、Asp469、Asp572、Trp573、Trp745、Glu746、Ser758和His761的氨基酸殘基高度保守,其中Asp456、Glu462、Asp469和Glu746在底物結(jié)合方面和生物催化活性上起到重要作用[4-5]。圖1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明,TpdRha和DtRha進化關(guān)系相近,屬于一個進化分支,研究報導(dǎo)DtRha具有水解橙皮苷為橙皮素單葡萄糖苷的活性[6],為研究TpdRha的水解橙皮苷的活性提供了進化理論基礎(chǔ)。

    圖1 TpdRha系統(tǒng)發(fā)育進化樹

    2.2 TpdRha基因克隆

    將TpdRha克隆至pPIC9K載體上。圖2A是使用AOX引物進行菌液PCR鑒定的結(jié)果,可以得到約2 800 bp大小的片段,測序正確。對構(gòu)建成功的重組菌命名為Top10-pPIC9K-TpdRha,保留菌種,培養(yǎng),提取質(zhì)粒(圖2B)。

    圖2 pPIC9K-TpdRha克隆及質(zhì)粒提取

    2.3 構(gòu)建pPIC9K-TpdRha重組表達畢赤酵母菌

    線性化pPIC9K-TpdRha質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115和KM71H中,得到的重組表達菌株分別命名為GS115-TpdRha和KM71H-TpdRha。挑選單菌落通用引物AOX進行菌落PCR鑒定。

    圖3為重組畢赤酵母菌液PCR鑒定結(jié)果。圖3A結(jié)果顯示GS115-TpdRha陽性菌株在2 200 bp出現(xiàn)AOX條帶以及在2 800 bp左右出現(xiàn)目的基因條帶,由于TpdRha基因大小為2 600 bp,當(dāng)重組載體整合于GS115基因組后,TpdRha基因與pPIC9K兩端序列同源臂結(jié)合,在PCR擴增時,目的基因?qū)⒆兂? 800 bp的片段。結(jié)果表明,TpdRha基因?qū)崿F(xiàn)與畢赤酵母GS115基因組成功整合。

    圖3B結(jié)果顯示KM71H-TpdRha陽性菌株只在2 800 bp左右出現(xiàn)目的基因條帶,由于TpdRha基因大小約為2 600 bp,當(dāng)重組載體整合于KM71H基因組后,TpdRha基因與pPIC9K兩端序列同源臂結(jié)合,在PCR擴增時目的基因?qū)⒆兂? 800 bp的片段,而KM71H細胞本身不具有AOX基因,因此只出現(xiàn)一條條帶。結(jié)果表明,TpdRha基因?qū)崿F(xiàn)與畢赤酵母KM71H基因組成功整合。

    圖3 pPIC9K-TpdRha重組畢赤酵母鑒定

    2.4 TpdRha酶轉(zhuǎn)橙皮苷應(yīng)用

    重組表達菌株GS115-TpdRha和KM71HTpdRha經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后,分離得到粗酶液。以橙皮苷為底物進行反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC進行檢測。圖4檢測結(jié)果顯示,GS115-TpdRha和KM71HTpdRha異源表達得到的粗酶液均對橙皮苷有水解活性,轉(zhuǎn)化率分別為25.38%和36.64%,KM71HTpdRha表達得到的酶活相對更強。兩種不同宿主表達出來的活性存在差異,推測與TpdRha在宿主的糖基化或表達量有關(guān),其次與分泌表達后的降解率相關(guān)。對二者表現(xiàn)出的酶活差異,后續(xù)相關(guān)研究將采用KM71H-TpdRha重組菌進行優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)TpdRha,為其進一步應(yīng)用于以橙皮苷為底物生產(chǎn)橙皮素單葡萄糖苷奠定基礎(chǔ)。

    圖4 TpdRha異源表達活性檢測

    3 結(jié)論

    α-L-鼠李糖苷酶在天然產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化應(yīng)用中具有重大價值,從不同水平對其進行研究,可以為其在食品醫(yī)藥行業(yè)上的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。以可耐熱生長的T.petrophila的α-L-鼠李糖苷酶為目標(biāo),對其氨基酸序列進行分析,發(fā)現(xiàn)其含有876個氨基酸殘基,無信號肽序列,有糖基化位點和4個保守超家族結(jié)構(gòu)域。序列比對顯示TpdRha與DtRha同源性較高,為46.25%;多重序列比對結(jié)果顯示TpdRha有10個氨基酸殘基位點高度保守;經(jīng)3D結(jié)構(gòu)分析推測Asp456、Glu462、Asp469和Glu746在底物結(jié)合方面與生物催化活性上起重要作用;系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果顯示TpdRha與DtRha屬于同一個進化分支。

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