表面活性劑單體引起的細(xì)胞膜失穩(wěn)

王 平, 盛 潔, 雷一騰, 馬貝貝，朱 濤，蔣中英,

(1. 伊犁師范大學(xué)電子與信息工程學(xué)院 微納電傳感技術(shù)與仿生器械重點(diǎn)實驗室, 伊寧市 8350002. 南京大學(xué)物理學(xué)院 固體微結(jié)構(gòu)物理國家重點(diǎn)實驗室, 南京市210093)

1引 言

表面活性劑是一類能夠顯著降低物質(zhì)表面張力的雙親分子. 與細(xì)胞膜作用, 可實現(xiàn)細(xì)胞裂解、脂質(zhì)體外排與膜組分搜集等. 常用的單鏈表面活性劑的物理性質(zhì)主要由其帶電性、疏水鏈長度等決定[1, 2]. 需要選擇表面活性劑以實現(xiàn)特定的功能, 如陽離子型的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)被用于提取負(fù)電性生物大分子[3], 吸附自促進(jìn)的十二烷基硫酸鈉(SDS)被用于搜集失活的膜蛋白[4], 對氫鍵作用影響較弱的Triton X-100被用于提取磷脂筏結(jié)構(gòu)[5].

高于臨界成膠束濃度(CMC), 表面活性劑可組裝為膠束. 聚集狀態(tài)的表面活性劑可將生物膜組分拔出原始的雙層膜結(jié)構(gòu), 使后者的完整性嚴(yán)重受損[6]. 但低于CMC, 以單體狀態(tài)存在的表面活性劑分子與生物膜的相互作用的機(jī)制與調(diào)控的認(rèn)識仍存在很多不足.

Tamm等報道了表面活性劑單體可插入生物膜結(jié)構(gòu), 并考察了結(jié)合速率常數(shù)與疏水鏈長間的關(guān)聯(lián)[7]. 插入生物膜的分子可以顯著地改變了前者的側(cè)向流動性、剛性、主轉(zhuǎn)變溫度等性質(zhì)[8-10]. 但變化的方向與程度由磷脂膜與表面活性劑的組分共同決定[9]. 同時, 插入分子產(chǎn)生的膜內(nèi)外葉非對稱與過量膜面積是否會引起三維結(jié)構(gòu)重組也是一個開放的問題. 在低濃度下, 月桂酸酯等表面活性劑插入產(chǎn)生了微管或出芽結(jié)構(gòu)[11], 但多肽表面活性劑卻未引起相應(yīng)的膜三維形態(tài)重構(gòu)[12].

探索單體狀態(tài)的表面活性劑與生物膜作用是極其重要的課題. 即使在CMC以上, 仍存在以單體態(tài)存在的表面活性劑[2], 需要區(qū)分單體和膠束態(tài)對生物膜產(chǎn)生的差異. 在本文中, 我們采用了三種常用代表性表面活性劑與仿生磷脂膜作用, 分別是陰離子SDS、陽離子CTAB及非離子Triton X-100. 在CMC以下, 考查了它們的插入對膜形態(tài)、完整性的影響, 并進(jìn)一步建立了與細(xì)胞毒性間的關(guān)聯(lián). 我們的研究在分子水平深化了磷脂與表面活性劑的作用方式、調(diào)控手段的理解.

2實驗部分

2.1實驗材料

二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)購于Avanti Polar Lipids. Hela 細(xì)胞株、DiI、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液購于江蘇凱基生物技術(shù)公司. 其它化學(xué)試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司. 所有試劑均為分析純.

2.2支撐膜與表面活性劑溶液的制備

磷脂支撐膜(SLBs)通過DOPC囊泡在二氧化硅或玻璃襯底自發(fā)融合制備, 囊泡通過擠出法在Tris-HCl緩沖液中制備, 詳見我們之前的報道[13]. 表面活性劑以給定濃度(C)溶于Tris-HCl緩沖液(模型膜實驗)或DMEM溶液(細(xì)胞實驗)中, 在實驗前超聲并離心除氣. 本研究的所有實驗溫度均控制在37 ℃, 數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差均為三次以上實驗的結(jié)果.

2.3臨界成膠束濃度的檢測

采用LS55熒光光譜儀(PerkinElmer)表征了1-芘甲醛熒光隨表面活性劑濃度的變化(激發(fā)波長365nm, 發(fā)射波長400 - 600nm). 當(dāng)熒光發(fā)射峰(λpeak)為473 nm時表面活性劑以單體形式存在, 發(fā)生峰藍(lán)移則表示達(dá)到CMC[11].

2.4石英電子微天平及耗散系數(shù)表征(QCM-D)

QCM-D在E1(Qsense AB)上進(jìn)行, 使用二氧化硅沉積的石英芯片. 通過共振頻率(Δf)、耗散系數(shù)的偏移(ΔD)表征了芯片表面吸附層的質(zhì)量與粘滯性變化. Δf與質(zhì)量成正比, ΔD與耗散性成正比.

2.5熒光顯微觀測

在DOPC囊泡中摻雜1 mol% DiI熒光染料, 使用IX73熒光顯微鏡(Olympus, 100倍油鏡)與控溫灌流艙(Warner)對蓋玻片襯底(Fisher)的SLBs、及其接觸表面活性劑溶液后的熒光圖像進(jìn)行了表征.

2.6MTT實驗

表面活性劑對Hela細(xì)胞的毒性通過MTT比色法進(jìn)行了檢測. Hela細(xì)胞在96孔板鋪板后24小時, 加入給定濃度的表面活性劑DMEM溶液. 培養(yǎng)6 h后再加入MTT溶液, 孵化4 h后, 將底部沉淀溶于DMSO進(jìn)行紫外吸收檢測(Bio-Rad 680, 檢測波長570 nm). 每個樣品進(jìn)行了五個重復(fù)實驗.

3結(jié)果與討論

首先, 基于疏水探針1-芘甲醛在水相與膠束中的熒光發(fā)射峰差異, 熒光光譜表征了三種表面活性劑的CMC. 如圖1所示, 當(dāng)CTAB在低濃度以單體存在時(CCTAB0.7 mM), 1-芘甲醛的λpeak為～ 473nm. 當(dāng)CTAB濃度提高形成膠束后(CCTAB> 0.8 mM), λpeak逐漸藍(lán)移. 由圖1可得, CTAB、SDS與Triton-100的CMC分別為0.8, 5, 0.2mM. Triton X-100的CMC低于前兩者, 與早先報道一致[14]. 因此本研究將C限制在180 μM以下, 確保表面活性劑均以單體形式存在.

隨后, 通過QCM-D表征了三種表面活性劑與DOPC磷脂膜的相互作用. DOPC是生物膜中常見的雙電性磷脂. 許多研究基于該磷脂, 考察了模型膜與雙親分子相互作用, 發(fā)現(xiàn)能雙親分子能引起DOPC膜的三維空間形態(tài)變化[11, 15]. 而QCM-D能夠敏感地捕捉此動力學(xué)過程. Δf、ΔD分別反映著吸附層的質(zhì)量和粘彈性變化. 實驗步驟如圖2A所示, 首先在二氧化硅襯底表面沉積囊泡以形成SLBs. 沉積平衡時的Δf～ -25 Hz和ΔD< 10-6表明形成了完整的SLB結(jié)構(gòu). 之后泵入表面活性劑溶液(C= 100 μM).

三種表面活性劑產(chǎn)生的膜響應(yīng)具有顯著區(qū)別. 對于Triton X-100, Δf大幅降低, 說明大量表面活性劑進(jìn)入吸附層; ΔD顯著增高, 說明表面活性劑引發(fā)磷脂膜明顯的形態(tài)變化. 同時, 緩沖液漂洗后, Δf、ΔD可回落到初始值, 說明高耗散的結(jié)構(gòu)與吸附層并非緊密相連, 可被溶液環(huán)境中的機(jī)械擾動分離開. 而對于CTAB與SDS, Δf、ΔD僅有小幅偏移, 表明僅有微量表面活性劑插入磷脂層, 造成了很低的膜耗散性提高. 在15 min的作用時間內(nèi), Triton X-100、CTAB、SDS引起的平均Δf偏移分別為-6.4、-1.2、-0.1 Hz, ΔD偏移分別為2.4、0.28、0.1510-6. 因此, 非帶電性Trition-100能夠誘導(dǎo)最為顯著的膜變化.

隨后, 改變了三種表面活性劑的溶液濃度, 在C= 10 - 100 μM范圍內(nèi), 發(fā)現(xiàn)QCM-D的測量偏移量是與C直接相關(guān)的(圖2B). 較高的C產(chǎn)生了較大的Δf、ΔD偏移, 說明表面活性劑物質(zhì)的量是誘發(fā)磷脂膜形態(tài)變化的決定因素. 而當(dāng)C10 μM, Δf、ΔD的偏移基本消失.

圖2 QCM-D表征表面活性劑與SLBs的相互作用. (A) Δf - t 與ΔD - t 圖. (B) 在SLBs與CTAB (紅)、SDS (綠)、Triton X-100 (藍(lán))作用15 min后, Δf、ΔD的偏移.Fig. 2 QCM-D characterization of the interaction between detergents and SLBs. (A) Δf - t and ΔD - t curves. (B) Shifts of Δf, ΔD after 15 min interaction between SLBs and CTAB (red), SDS (green), and Triton X-100 (blue).

圖3 SLBs與表面活性劑作用前后的熒光顯微表征. (A) 完整SLB, 及其與(B) CTAB、(C) SDS、(D) Triton X-100作用15 min后的熒光顯微圖. 示意圖中黃色、綠色、紫色、藍(lán)色分別表示DOPC、CTAB、SDS和Triton X-100. 比例尺長度為10 μm. Fig. 3 Fluorescence microscopy imaging of detergent-induced membrane morphological responses. Fluorescence images of (A) intact SLB; 15 min after the interaction between the membranes and (B) CTAB, (C) SDS, (D) Triton X-100. Yellow, green, purple, and blue represent DOPC, CTAB, SDS, and Triton X-100, respectively. The scale bar represents 10 μm.

進(jìn)一步在DOPC磷脂膜中摻雜1 mol% DiI染料, 熒光顯微技術(shù)表征了表面活性劑作用前后SLB的形態(tài)變化. 如圖3所示, SLB是一個均質(zhì)的磷脂膜結(jié)構(gòu). 在與Triton X-100作用后, 膜表面形成了大量微泡出芽結(jié)構(gòu), 該結(jié)構(gòu)可以被緩沖液漂洗除去. 而SLB與CTAB作用后, 表面出現(xiàn)了明暗光強(qiáng)不均的分布, 表明膜結(jié)構(gòu)可能出現(xiàn)了非均的高度差異, 這在pH誘導(dǎo)的膜在組裝中也被觀察到[15]. SLB與SDS作用后變化最小. 因此, 熒光顯微觀測與QCM-D的結(jié)果一致, Triton X-100可誘發(fā)最為顯著的膜形態(tài)變化.

我們對不同表面活性劑產(chǎn)生的效應(yīng)差異進(jìn)行了分析. CTAB與SDS分別帶正電與負(fù)電, 而Triton X-100不帶電(圖1). 一方面, 由于自身分子間的靜電排斥, 初始插入磷脂膜的SDS或CTAB會抑制進(jìn)一步的表面活性劑進(jìn)入, 從而使磷脂膜內(nèi)的表面活性劑濃度限制在較低水平(較低的Δf偏移). 但插入分子產(chǎn)生的過量膜面積會造成膜彎曲[15], 形成高低不均的分子層結(jié)構(gòu)(熒光非均質(zhì)). 這使得分子間過量壓力得以釋放, SLB下側(cè)的高耗散水增多(ΔD略增大). 另一方面, 由于自身分子間不存在靜電排斥, 初始插入磷脂膜的Triton X-100不會抑制進(jìn)一步的表面活性劑進(jìn)入(較高的Δf偏移). 在過量膜面積與分子自發(fā)曲率誘導(dǎo)的富集效應(yīng)[16]下, 更容易形成高曲率的高耗散出芽結(jié)構(gòu)(較高的ΔD偏移和熒光出芽點(diǎn)). 這種出芽結(jié)構(gòu)能夠在外力的作用下失穩(wěn)并脫離底面, 破壞磷脂膜的整體完整性.

最后, 考察了表面活性劑的模型膜響應(yīng)行為是否影響到了細(xì)胞的正常生理功能. 在Hela細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液中加入了10 - 180 μM表面活性劑, 基于MTT實驗表征細(xì)胞的活力. 發(fā)現(xiàn)Triton X-100在100 μM的濃度即可對細(xì)胞活性產(chǎn)生影響. 當(dāng)CCTAB= 180 μM, 細(xì)胞活力下降(Vc)至80.2%. 而在實驗濃度范圍內(nèi), SDS與CTAB并未對細(xì)胞正常生理行為產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng). 因此, Triton X-100產(chǎn)生的生物膜三維結(jié)構(gòu)的再組裝可能影響了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與功能.

圖4 MTT表征表面活性劑溶液環(huán)境中的Hela細(xì)胞活力.Fig. 4 MTT characterization of the effects of DDG and GML on human cell viability.

4結(jié) 論

在CMC以上表面活性劑與生物膜的作用與調(diào)控機(jī)制已經(jīng)被深入研究了. 但以單體存在的表面活性劑如何與生物膜相互作用仍是一個開放的問題. 在本文中, 我們考察了三種不同離子型的表面活性劑與生物膜的相互作用. 研究發(fā)現(xiàn), 在CMC以下, 非離子型Triton X-100能誘發(fā)最為顯著的膜形態(tài)變化, 并引發(fā)細(xì)胞活力的異常. 機(jī)理分析表明, Triton X-100具有較弱的分子間靜電排斥, 使得它更易大量地插入生物膜, 從而誘導(dǎo)形成高曲率的非穩(wěn)出芽微泡結(jié)構(gòu). 而帶電的CTAB或SDS由于分子間靜電排斥, 限制了表面活性劑分子的大量插入, 從而降低了對膜形態(tài)和完整性的負(fù)面影響. 我們的研究深化了表面活性劑與生物膜作用機(jī)制的理解, 對表面活性劑在生物醫(yī)藥、膜組分萃取等領(lǐng)域的深化應(yīng)用提供了指導(dǎo)與幫助.