黑根霉Q3Y在旱脅迫效應(yīng)下的菌絲生長(zhǎng)特性及糖化產(chǎn)物

楊云娟，錢(qián) 紅，車(chē)云巧，肖 伶，郭海靜，蘇艷歡，周 瑋，唐湘華，黃遵錫*

（1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué) 生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500；3.云南省酶工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500）

根霉菌[1]為毛霉科，根霉屬，是自然界中廣泛存在的一類(lèi)真菌，為我國(guó)數(shù)種傳統(tǒng)發(fā)酵食品的重要優(yōu)勢(shì)菌[2]，被大量用于米酒、黃酒的糖化過(guò)程[3-4]。根霉在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生大量的淀粉酶、糖化酶[5-6]、蛋白酶[7]、脂肪酶[8-10]，而且還能產(chǎn)生蘋(píng)果酸、富馬酸、乳酸、琥珀酸等有機(jī)酸[11-13]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工和能源等眾多領(lǐng)域[14-15]。

根霉為絲狀真菌，能在固態(tài)培養(yǎng)模型下生長(zhǎng)，以頂端細(xì)胞延伸和分枝進(jìn)行生長(zhǎng)，根霉菌絲延伸過(guò)程中受到培養(yǎng)基的含水量和蓬松程度的影響[16]，氣生菌絲容易形成孢子，導(dǎo)致固態(tài)培養(yǎng)載體上生長(zhǎng)不均，形成的代謝產(chǎn)物差異性較大[17]。

根霉菌的固態(tài)發(fā)酵，其種子質(zhì)量成為固態(tài)發(fā)酵成功的重要指標(biāo)。而使用的種子常采用液態(tài)種子和固態(tài)種子[18]。固態(tài)種子在培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)種子污染問(wèn)題和菌絲過(guò)早產(chǎn)生孢子現(xiàn)象，同時(shí)還會(huì)伴隨著黑曲霉、青霉、細(xì)菌的污染。而液態(tài)培養(yǎng)根霉，根霉菌絲生長(zhǎng)在水中由于受阻力小，菌絲延伸容易，形成的菌絲體也比較粗壯，但培養(yǎng)后期菌體容易受搖床的回旋作用導(dǎo)致菌絲容易纏繞成團(tuán)，呈絮凝團(tuán)狀，菌絲體分散度差，作為液體種子會(huì)導(dǎo)致接種不均勻，菌絲生長(zhǎng)不均衡，代謝產(chǎn)物差異較大，不利于作為固態(tài)發(fā)酵的液體種子使用。

本實(shí)驗(yàn)采用黑根霉（Rhizopus nigricans）Q3Y作為實(shí)驗(yàn)菌株，通過(guò)液體發(fā)酵方式，調(diào)節(jié)液體發(fā)酵液中的游離水，以瓊脂多糖吸水特性，吸附游離水形成膠體物，形成缺水現(xiàn)象，模擬固態(tài)發(fā)酵模式，研究該菌株的生長(zhǎng)特性，分析不同黏度下菌絲生長(zhǎng)的情況。

糯米作為一種重要的淀粉質(zhì)原材料，具有黏性，加水形成的培養(yǎng)基黏性高，和設(shè)置的黏性液體發(fā)酵模型相類(lèi)似，通過(guò)以糯米培養(yǎng)液為測(cè)試對(duì)象，分析了糯米發(fā)酵制糖過(guò)程中可溶性總糖、還原糖、寡糖和菌株產(chǎn)糖化酶的變化規(guī)律，為制備功能性發(fā)酵黑糖降低能耗和縮短操作環(huán)節(jié)，為高濃度寡糖漿[19]，功能性寡糖[20-21]的可行性制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

黑根霉（Rhizopus nigricans）Q3Y菌種：云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；馬鈴薯（云南合作88）、糯米（昆明富民產(chǎn)地）：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海藍(lán)季生物公司；可溶性淀粉（生化試劑）：菱湖精細(xì)化工廠(chǎng)；瓊脂粉、麥芽糖（均為生化試劑）：上海藍(lán)季生物公司；氫氧化鈉（分析純）：上海試驗(yàn)四赫維化工有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：上海申博化工有限公司；無(wú)水亞硫酸鈉（分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚（分析純）：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子活化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：新鮮土豆切塊，稱(chēng)取40.0 g，加入200 mL水，放入打漿機(jī)中搗漿，裝到500 mL燒杯中，煮沸10 min，200目濾袋過(guò)濾，調(diào)節(jié)過(guò)濾液pH值為7.0，加入4.8 g瓊脂粉，攪拌后，包扎，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121 ℃滅菌30 min，冷卻到60 ℃，每個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中倒入15.0 mL，制備PDA平板。

種子培養(yǎng)基：新鮮土豆切塊，稱(chēng)取40.0 g，加入160.0 mL水，放入打漿機(jī)中搗漿，裝到500.0 mL的燒杯中，煮沸10 min，200目濾袋過(guò)濾，調(diào)節(jié)過(guò)濾液pH為7.0。取250.0 mL的三角瓶，每個(gè)瓶中裝入100.0 mL土豆汁溶液和0.5 g瓊脂粉，搖晃均勻后包扎，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121 ℃滅菌30 min，冷卻待用。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；UV-5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；WAY-2w阿貝折光儀：上海光學(xué)儀器廠(chǎng)；NDJ-5S數(shù)顯黏度計(jì)：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；XZ-J20B打漿機(jī)：中山市富卓電器有限公司；DEL7a 320 pH計(jì)：梅特勒托利多公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；MQL-621R迴轉(zhuǎn)式搖床：上海旻泉儀器有限公司；CX22LEDRFS1 奧林巴斯顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑根霉Q3Y菌種的活化及種子液的制備

菌種活化：取滅菌的PDA平板，使用接種環(huán)挑取黑根霉Q3Y表面上的孢子在平板上畫(huà)線(xiàn)，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待種子長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板，取出放在4 ℃冰箱保藏。

種子液的制備：取種子培養(yǎng)基，挖起平板中的菌種塊約φ2 cm，接種到種子液中，包扎好后放在28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h。

1.3.2 黏度的測(cè)定

將黏度計(jì)用水清洗干凈且擦干，調(diào)節(jié)黏度計(jì)水平狀態(tài)，而后將2#轉(zhuǎn)子放入樣品中進(jìn)行測(cè)定，記錄數(shù)值。

1.3.3 糖化酶酶活力的測(cè)定[6]

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，用試管分別取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL的葡萄糖溶液，依次補(bǔ)水1.9 mL、1.8 mL、1.7 mL、1.6 mL、1.5 mL、1.4 mL、1.3 mL、1.2 mL、1.1 mL、1.0 mL，再向每個(gè)試管中分別加入3.0 mL DNS溶液，放入沸水浴中煮沸5.0 min，冷卻，定容為至15.0 mL，混勻，于波長(zhǎng)540 nm條件下測(cè)定吸光度值（OD540nm值），以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程y=0.473x-0.019，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。

糖化酶酶活定義：在50 ℃，pH 4.5的條件下，每分鐘水解10.0 mg/mL的淀粉底物溶液產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3.4 可溶性總糖及還原糖含量的測(cè)定

紗布過(guò)濾根霉菌株Q3Y培養(yǎng)液，使用移液器吸取過(guò)濾液到1.5 mL離心管中，于15 000 r/min條件下離心5.0 min，收集上清液，待用。

可溶性總糖的測(cè)定：取上清液，用阿貝折射儀進(jìn)行可溶性總糖測(cè)定；

還原糖的測(cè)定：取離心上清液0.1 mL加入干凈試管中，加入1.8 mL水，加入3.0 mL DNS試劑，在沸水浴中反應(yīng)5.0 min，取出冷卻，加入10.0 mL單蒸水，混合均勻；空白管中加入2.0 mL單蒸水和3.0 mL DNS試劑，在沸水浴中反應(yīng)5.0 min，取出冷卻，加入10.0 mL單蒸水，混合均勻。以空白管為對(duì)照，在波長(zhǎng)540.0 nm條件下比色，測(cè)定OD540nm值，通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算還原糖含量。

1.3.5 土豆培養(yǎng)基黏度對(duì)菌株Q3Y種子生長(zhǎng)的影響

取400 g新鮮土豆，切塊，加入400 mL水，放入打漿機(jī)中搗碎，定容至2 000 mL，煮沸，200目濾袋過(guò)濾得上清液分裝15個(gè)三角瓶，每瓶裝100.0 mL，瓊脂粉添加量分別為0、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%，每個(gè)水平重復(fù)3次，置于高壓蒸汽滅菌鍋中于0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到25 ℃，使用黏度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基的黏度。

在每瓶含20%的土豆汁培養(yǎng)基中分別添加瓊脂粉含量為0、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%，于121 ℃條件下滅菌30 min。待冷卻后，在超菌臺(tái)中取根霉Q3Y平板的菌絲塊（約φ2 cm）接入到三角瓶中，接種量約為3%。接種后置于28℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)35～40 h，取菌絲體通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；取發(fā)酵液在15 000 r/min條件下離心5.0 min，取上清液測(cè)定還原糖及可溶性總糖含量。

1.3.6 糯米原料發(fā)酵分析

取8個(gè)300 mL三角瓶，糯米與蒸餾水的料水比分別為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、7∶10、8∶10（g∶mL），配制含水量為90.0%、83.3%、77%、71.4%、66.7%、62.5%，58.8%和55.0%的糯米培養(yǎng)基。將糯米培養(yǎng)基放置于0.1 MPa、115 ℃條件下蒸煮40 min，冷卻至30 ℃，觀察分析不同水分含量的糯米培養(yǎng)基的黏稠性及吸收膨脹狀態(tài)。

取8個(gè)2 L的不銹鋼盆，做好標(biāo)記，糯米與蒸餾水的料水比分別為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、7∶10、8∶10（g∶mL），攪拌混勻使用紗布封口包扎，在115.0 ℃滅菌40.0 min，取出冷卻，按糯米質(zhì)量的10%接種量接種菌株Q3Y種子液，攪拌使糯米與黑根霉Q3Y菌種充分混合均勻，然后用保鮮膜密封盆口，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，每隔12 h 取樣測(cè)定發(fā)酵液中的pH、可溶性總糖及酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同瓊脂粉添加量對(duì)土豆汁培養(yǎng)基黏度的影響

圖1 瓊脂粉添加量對(duì)土豆汁培養(yǎng)基黏度的影響Fig.1 Effect of agar powder addition on viscosity of potato juice medium

由圖1可知，土豆汁培養(yǎng)基起始黏度僅有100 mPa·s，由于黏度低，培養(yǎng)液濁度較清，形成的菌絲體生長(zhǎng)較差；隨著瓊脂粉添加量增加，培養(yǎng)基的黏度快速增加；瓊脂添加量為0.50%時(shí)，溶液黏度為500 mPa·s，根霉菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)良好，菌懸液均勻，菌絲細(xì)膩，分散均勻，非常有利于液態(tài)培養(yǎng)根霉Q3Y菌株的生長(zhǎng)；瓊脂添加量為1.00%土豆汁培養(yǎng)基的黏度達(dá)到了2 500 mPa·s，液體的流動(dòng)性變得非常差，發(fā)現(xiàn)黏度過(guò)大的土豆培養(yǎng)基中根霉菌絲體生長(zhǎng)較差，而在添加瓊脂少的培養(yǎng)液中成團(tuán)，分散度弱，菌絲均勻度也是非常差。因此，通過(guò)適當(dāng)增加黏度，提高溶液的張力，提高游離水的飽和度，無(wú)自由析出，模擬干旱脅迫效應(yīng)，容易加速根霉菌絲細(xì)胞的深層培養(yǎng)，大量的菌絲細(xì)胞成為基內(nèi)菌絲體，不易產(chǎn)生氣生孢子。

2.2 土豆汁培養(yǎng)基黏度對(duì)菌株Q3Y細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

為了研究根霉在高黏度固態(tài)培養(yǎng)中菌絲生長(zhǎng)狀況及延伸情況，本實(shí)驗(yàn)在所使用的土豆培養(yǎng)基中添加了一定的瓊脂，模擬糯米黏度的特性，讓根霉在不同黏度的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，在不同黏度的培養(yǎng)基中，種子的生長(zhǎng)狀況有所差異。4種不同黏度的培養(yǎng)基在種子的培養(yǎng)過(guò)程中，所產(chǎn)生的總糖和pH相差不大，但在菌絲生長(zhǎng)形態(tài)上有著一定的差異。無(wú)添加瓊脂的培養(yǎng)基和添加瓊脂為0.10%形成的黏性培養(yǎng)基，其菌絲細(xì)胞較小，這可能是因?yàn)榫w在振蕩培養(yǎng)過(guò)程中，由于培養(yǎng)液濁度較清，菌絲比較容易發(fā)生斷裂，根霉菌具有一定的黏附性，在濁度較輕的培養(yǎng)液中，根霉菌的菌絲容易成團(tuán)生長(zhǎng)，不易分散，因此此種培養(yǎng)基黏度下，菌絲細(xì)胞較小。添加瓊脂為0.50%的培養(yǎng)基黏度，能使根霉菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)比較理想，通過(guò)顯微鏡觀察可得，此黏度下的菌絲細(xì)胞比較均勻，這樣可以使其更加容易在固態(tài)的培養(yǎng)基中延伸生長(zhǎng)。因此，選擇添加0.50%瓊脂的土豆培養(yǎng)基更適于黑根霉Q3Y菌株的生長(zhǎng)。

表1 培養(yǎng)基黏度對(duì)黑根霉Q3Y菌絲生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of medium viscosity on the mycelia growth of Rhizopus nigricans Q3Y

2.3 糯米原料發(fā)酵分析

2.3.1 不同含水量糯米的物理特性

不同含水量的糯米物理特性分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，含水量為58.8%和62.5%的糯米黏稠性和膨松度較好，顆粒軟硬度適中，容易成團(tuán)，有利于霉菌的生長(zhǎng)，在該水分下的糯米特性屬于固態(tài)發(fā)酵的特性，沒(méi)有游離水，適合于根霉的生長(zhǎng)。因此，根據(jù)糯米含水量的特性，為便于黑根霉的菌絲延伸及其生長(zhǎng)，選擇料水比為6∶10（g∶mL）（含水率62.5%）和7∶10（g∶mL）（含水率58.8%）的糯米培養(yǎng)基進(jìn)行菌種發(fā)酵。

表2 不同含水量糯米的物理特性Table 2 Physical properties of glutinous rice with different water contents

2.3.2 不同含水量糯米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物及原料利用率分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了在相同接種量、培養(yǎng)溫度條件下，根霉在料水比為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、7∶10、8∶10（g∶mL）的熟糯米培養(yǎng)基上的進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)可溶性總糖和還原糖的測(cè)定，分析了根霉生長(zhǎng)對(duì)糯米淀粉的利用及原料利用率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2a和2b可知，隨著根霉菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，伴隨著菌絲細(xì)胞的延伸，糯米中的淀粉多糖被菌絲細(xì)胞水解形成水溶性多糖和還原糖，在料水比為6∶10（g∶mL）的發(fā)酵液中，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，可溶性總糖及還原糖含量分別為32 g/100 mL、26 g/100 mL，表明大量的淀粉被水解，可溶性總糖和還原糖呈正相關(guān)性，大量的可溶性總糖被逐漸轉(zhuǎn)化為還原性單糖，這種現(xiàn)象也是符合根霉的雙邊發(fā)酵特性[20]，邊生長(zhǎng)邊水解淀粉，導(dǎo)致淀粉原料被徹底水解成還原糖。由圖2c可知，料水比低的培養(yǎng)基中原料利用率最高，而在料水比為8∶10（g∶mL）的糯米培養(yǎng)基中，形成了高濃度糯米培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水率為55.6%，糯米顆粒硬，黏度高，顆粒蓬松度差，根霉生長(zhǎng)水解72 h，原料的利用率只有14.8%。其原因主要是培養(yǎng)基中的糯米固形物濃度大，培養(yǎng)基中的游離水少，糖化酶在沒(méi)有水分子參與條件下不能進(jìn)一步催化水解淀粉，導(dǎo)致形成的還原糖產(chǎn)物較少；而游離水的減少導(dǎo)致糖苷水解糖類(lèi)的催化能力降低，不利于代謝產(chǎn)物糖化酶對(duì)淀粉的降解。所以料水比越高，根霉菌絲體生長(zhǎng)就弱，細(xì)胞延伸阻力大，形成的糖化酶產(chǎn)量也低。所以，在進(jìn)行利用根霉進(jìn)行制糖工藝研究中，使用料水比為6∶10（g∶mL）和7∶10（g∶mL）的培養(yǎng)基有利于發(fā)酵生產(chǎn)。

圖2 黑根霉Q3Y發(fā)酵糯米水解產(chǎn)物各項(xiàng)指標(biāo)分析Fig.2 Analysis of hydrolysis product in Rhizopus nigricans Q3Y fermentation with glutinous rice medium

2.3.3 不同含水量糯米培養(yǎng)基發(fā)酵糖化酶活性分析

圖3 黑根霉Q3Y發(fā)酵糯米培養(yǎng)基中糖化酶活力分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of glucoamylase activity in Rhizopus nigricans Q3Y fermentation with glutinous rice medium

將種子液接種到料水比為6∶10（g∶mL）和7:10（g∶mL）的糯米中進(jìn)行培養(yǎng)24 h后，每隔12 h取樣測(cè)定糖化酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，料水比為6∶10（g∶mL）和7∶10（g∶mL）的糯米培養(yǎng)液中的酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增高，且兩者的產(chǎn)酶能力差異不大；還原糖含量隨糖化酶活力增大而增加（見(jiàn)圖2b），二者呈正相關(guān)。在料水比為6∶10（g∶mL）糯米培養(yǎng)液中，根霉發(fā)酵72 h，其糖化酶活力達(dá)到23.0 U/mL。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用人為設(shè)置的脅迫環(huán)境，將黑根霉Q3Y菌株置于高黏度糯米培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)根霉在添加0.5%瓊脂的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，形成的培養(yǎng)懸浮液均勻穩(wěn)定，培養(yǎng)后的菌絲形態(tài)分散，生物量高，菌絲細(xì)胞均勻。通過(guò)制備的種子液用于糯米發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明根霉菌對(duì)糯米原料的分解能力非常好；在料水比為6∶10（g∶mL），含水量為62.5%的糯米培養(yǎng)基中的可溶性總糖能達(dá)到32g/100mL，還原糖能達(dá)到26g/100mL。在對(duì)代謝產(chǎn)物糖化酶分析中發(fā)現(xiàn)，根霉發(fā)酵72h，其糖化酶活力能達(dá)到23.0U/mL。表明通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的黏液，脅迫菌絲細(xì)胞朝液體深層延伸、生長(zhǎng)，是適合菌體生長(zhǎng)的一種理想液體發(fā)酵培養(yǎng)模式，有利于延長(zhǎng)菌絲體的生長(zhǎng)周期，減少霉菌孢子的生成，提高生物量。