培養(yǎng)管硅膠顯色法直接檢測(cè)結(jié)核菌吡嗪酰胺耐藥性

瞿梅 黃飛 陳俊林 顧德林 胡忠義 丁元生

【摘要】 目的：利用培養(yǎng)管硅膠顯色法直接檢測(cè)臨床涂陽(yáng)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌（MTB）吡嗪酰胺（PZA）藥物敏感性，并對(duì)該方法進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)。方法：對(duì)2016年6月-2017年10月在南通市第六人民醫(yī)院就診的158例肺結(jié)核患者涂陽(yáng)痰標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，利用Bactec MGIT960與培養(yǎng)管硅膠顯色法同步進(jìn)行PZA藥物敏感性檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：以Bactec MGIT960檢測(cè)PZA藥物敏感性結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)管硅膠顯色法靈敏度、特異性、符合率分別為96.8%、95.9%、96.7%。報(bào)告結(jié)果平均時(shí)間為（24.5±2.0）d，同Bactec MGIT960檢測(cè)時(shí)間相仿，報(bào)告時(shí)間與痰中MTB菌量及活力有相關(guān)性。結(jié)論：培養(yǎng)管硅膠顯色法可以替代Bactec MGIT960直接對(duì)臨床涂陽(yáng)痰標(biāo)本進(jìn)行PZA藥物敏感性檢測(cè)，結(jié)果可靠，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，滿足臨床快速診斷的需要，適合推廣使用。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)核分枝桿菌 吡嗪酰胺 藥物敏感性試驗(yàn) 硅膠顯色法 Bactec MGIT960

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.03.026 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2020）03-00-04

[Abstract] Objective： Using Culture tube silica gel assay to directly detect Pyrazinamide （PZA） drug sensitivity of mycobacterium tuberculosis （MTB） in clinical specimens of sputum smear-positive， and to evaluate clinical application of this method. Method： A total of 158 cases sputum smear-positive samples of pulmonary tuberculosis patients from June 2016 to October 2017 in Nantong Sixth Peoples Hospital were pretreatmented， PZA drug sensitivity test were synchronous detected by Bactec MGIT960 and culture tube silica gel assay， and the test results were compared. Result： The results of PZA drug sensitivity by Bactec MGIT960 as the judgment standard， sensitivity， specificity and accuracy of culture tube silica gel assay were 96.8%， 95.9% and 96.7% respectively. The average time of report results was for （24.5±2.0） d， similar with Bactec MGIT960 testing time， report time were correlationsand with the number of MTB in sputum and dynamic. Conclusion： The culture tube silica gel assay can replace Bactec MGIT960 for directly detecting PZA resistance of MTB in smear-positive sputum， the result is reliable， simple operation， low cost. It can meet the need of rapid clinical diagnosis and worthy in application.

[Key words] Mycobacteriurn tuberculosis Pyrazinamide Drug susceptibility Culture tube silica gel assay Bactec MGIT960

First-authors address： Nantong Sixth Peoples Hospital， Nantong 226011， China

隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)進(jìn)步，結(jié)核病精準(zhǔn)化治療已成為醫(yī)患雙方共同追求的目標(biāo)，作為特異感染性疾病，為避免無(wú)效用藥，快速精準(zhǔn)診斷患者感染的結(jié)核菌是否出現(xiàn)耐藥是制定有效治療方案的關(guān)鍵。相對(duì)于其他一線抗結(jié)核藥物能高效利用高分辨率熔解曲線、基因芯片等分子生物技術(shù)或者微量MIC、MODS等表型藥敏技術(shù)來(lái)進(jìn)行快速藥敏鑒定[1-3]，吡嗪酰胺（PZA）目前已知并被常用來(lái)檢測(cè)的耐藥基因pncA.很難覆蓋所有的基因突變位點(diǎn)[4-6]，因其獨(dú)特的殺菌條件要求被國(guó)外推薦最有效的表型藥敏檢查方法BACTC MGIT960[7-8]，因儀器和試劑價(jià)格昂貴而很難在國(guó)內(nèi)推廣應(yīng)用。本課題組充分利用現(xiàn)有MTB表型藥敏檢測(cè)技術(shù)并結(jié)合一些特殊新材料，設(shè)計(jì)生產(chǎn)了一種可視化MTB藥敏檢測(cè)新型產(chǎn)品—底部包含有適量變色硅膠的微孔板和培養(yǎng)管（微孔板和培養(yǎng)管僅存在培養(yǎng)載體差別，技術(shù)特征及設(shè)計(jì)性能完全一致），已在前期利用微孔板測(cè)試了MTB臨床分離株的PZA藥物敏感性，確定液體培養(yǎng)基最佳pH值在5.7～5.9、最佳接種菌量為0.25 mg/ml、MIC最佳判斷界值為200 μg/ml、7～14 d即可報(bào)告結(jié)果并制定了相應(yīng)的檢測(cè)流程[9]，本課題組就再次利用含有變色硅膠的培養(yǎng)管直接對(duì)臨床涂陽(yáng)痰標(biāo)本進(jìn)行PZA藥物敏感性測(cè)試，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 菌株來(lái)源 牛分枝桿菌菌株和MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株均采購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心，痰標(biāo)本來(lái)自于2016年6月-2017年10月在南通市第六人民醫(yī)院結(jié)核科就診的158例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者。肺結(jié)核痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性分級(jí)計(jì)數(shù)：以1+、2+、3+、4+記錄[10]。其中22例1+，23例2+，58例3+，55例4+。

1.1.2 試劑與儀器設(shè)備 PZA、對(duì)硝基苯甲酸（PNB）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Middlebrook7H9培養(yǎng)基干粉、61010A-1型比濁儀、BD培養(yǎng)液、Bactec MGIT960檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;隔水式培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;變色硅膠培養(yǎng)管，由上海積彩醫(yī)療器械有限公司提供。

1.1.3 試劑配制 液體培養(yǎng)基（pH 5.8）配制參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]，PZA先用去離子水溶解，再用配制的液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋?zhuān)罱K濃度設(shè)為200 μg/ml;PNB用配制的液體培養(yǎng)基稀釋?zhuān)罱K濃度為800 μg/ml。MIC最佳判斷界值為200 μg/ml。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 先取合格痰標(biāo)本1 ml置于試管內(nèi)，再加入4%NaOH液4 ml，進(jìn)行充分振蕩后移入37 ℃水浴箱內(nèi)，15 min后取出試管用1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行中和，離心后再次移入37 ℃水浴箱內(nèi)。

1.2.2 培養(yǎng)管硅膠顯色法檢測(cè)涂陽(yáng)標(biāo)本PZA敏感性 參考文獻(xiàn)[9]設(shè)定測(cè)試管、陰性對(duì)照管、陽(yáng)性對(duì)照管、PNB含藥管，測(cè)試管中加入0.4 ml終濃度為200μg/ml含PZA培養(yǎng)基，再接種標(biāo)本處理液0.4 ml;陰性對(duì)照管加不含藥7H9液體培養(yǎng)基0.8 ml、不接種MTB菌液，作為陰性控制;陽(yáng)性對(duì)照管加不含藥7H9液體培養(yǎng)基0.4 ml、接種MTB菌液0.4 ml。將培養(yǎng)管加蓋后置于37 ℃溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)管底硅膠顏色變化來(lái)判斷該測(cè)試孔內(nèi)MTB是否對(duì)RFP耐藥。判斷方法參考文獻(xiàn)[12-13]，若對(duì)照管內(nèi)底硅膠由天藍(lán)色變?yōu)辄S色，PNB含藥管底硅膠尚未變色，則說(shuō)明該標(biāo)本中分枝桿菌為MTB;若對(duì)照管內(nèi)底硅膠由天藍(lán)色變?yōu)辄S色，PNB含藥管底硅膠由天藍(lán)色變?yōu)辄S色，則說(shuō)明標(biāo)本中分枝桿菌為非結(jié)核分枝桿菌（NTM）。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照管底硅膠由天藍(lán)色變?yōu)辄S色，測(cè)試管底硅膠尚未變色，說(shuō)明測(cè)試管MTB生長(zhǎng)被藥物抑制，判為敏感;而當(dāng)測(cè)試管先于對(duì)照管或與對(duì)照管同時(shí)見(jiàn)管底硅膠顏色發(fā)生改變，說(shuō)明藥物不能抑制測(cè)試管MTB繁殖，判斷該測(cè)試管內(nèi)MTB對(duì)PZA耐受。

結(jié)果判斷：觀察為5～50 d，超過(guò)50 d不生長(zhǎng)需重復(fù)試驗(yàn)。質(zhì)量控制：每次試驗(yàn)均以牛分枝桿菌為耐藥株質(zhì)控，H37Rv為敏感株質(zhì)控。

1.2.3 BACTEC MGIT960檢測(cè)PZA藥物敏感性 按照文獻(xiàn)[14]及BACTEC MGIT960 操作說(shuō)明，吸取標(biāo)本處理液0.5 ml加入到 MGIT960液體培養(yǎng)管中，培養(yǎng)7～10 d后選取陽(yáng)性培養(yǎng)管，吸取1 ml陽(yáng)性培養(yǎng)液至4 ml無(wú)菌生理鹽水中作為稀釋菌液，再以此稀釋菌液按照1∶100進(jìn)行稀釋作為對(duì)照，吸取500 μl稀釋菌液加有PZA的藥物培養(yǎng)管中顛倒混勻（培養(yǎng)基的藥物濃度為200 μg/mL），吸取500 μl稀釋菌液對(duì)照管中顛倒混勻，標(biāo)記后分別置入BACTEC MGIT960培養(yǎng)箱，儀器會(huì)在若干天之內(nèi)會(huì)自動(dòng)報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。質(zhì)量控制：每次藥敏試驗(yàn)均采用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為陽(yáng)性參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件作為分析工具，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)管硅膠顯色法與Bactec MGIT960檢測(cè)158例涂陽(yáng)痰標(biāo)本PZA藥敏結(jié)果

培養(yǎng)管硅膠顯色法檢測(cè)結(jié)果：鑒定為NTM 2例，鑒定為MTB 153例，培養(yǎng)陰性3例;敏感MTB 126例，耐藥MTB 27例。Bactec MGIT960檢測(cè)結(jié)果：鑒定為NTM 2例，鑒定為MTB 153例，培養(yǎng)陰性3例;敏感MTB 129例，耐藥MTB 24例。以Bactec MGIT960檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)管硅膠顯色法與Bactec MGIT960檢測(cè)方法結(jié)果相符合148例，不符合5例，符合率為96.7%（148/153）;培養(yǎng)管硅膠顯色法敏感度為96.9%（125/129），特異度為95.8%（23/24），見(jiàn)表1。

2.2 培養(yǎng)管硅膠顯色法與Bactec MGIT960檢測(cè)痰標(biāo)本PZA藥敏時(shí)間

從處理后的標(biāo)本加入培養(yǎng)管開(kāi)始計(jì)時(shí)，Bactec MGIT960藥敏報(bào)告時(shí)間為15～40 d，平均（23.3±2.0）d。培養(yǎng)管硅膠顯色法檢測(cè)時(shí)間16～44 d，平均（24.5±2.0）d。將兩者最終藥敏結(jié)果所需時(shí)間對(duì)比，培養(yǎng)管硅膠顯色法藥敏報(bào)告時(shí)間稍長(zhǎng)于Bactec MGIT960藥敏報(bào)告時(shí)間，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

現(xiàn)階段耐藥結(jié)核病特別是耐多藥結(jié)核病的流行已成為嚴(yán)重困擾中國(guó)公共衛(wèi)生的大問(wèn)題[15-16]，而PZA是被用來(lái)控制耐藥結(jié)核病的重要藥物。因PZA藥物敏感性試驗(yàn)要求非常高，因此國(guó)內(nèi)很少有機(jī)構(gòu)開(kāi)展PZA藥敏試驗(yàn)。為解決這一難題，本研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)制造出一種含變色硅膠的微孔板和培養(yǎng)管來(lái)嘗試檢測(cè)MTB對(duì)PZA藥物敏感性。設(shè)計(jì)原理及方法為：利用硅橡膠具有良好的二氧化碳吸附性能和固載酸堿指示劑離子能力[17-18]，將篩選的酸堿指示劑通過(guò)特殊工藝負(fù)載于硅膠固化，將適量的固載指示劑離子的變色硅膠通過(guò)特殊工藝附著在透明的微孔板或培養(yǎng)管底部。如果接種在微孔板患者培養(yǎng)管內(nèi)液體培養(yǎng)基中的標(biāo)本內(nèi)有活的MTB存在，其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)釋放二氧化碳（CO2）并通過(guò)透氣材料層和固載在硅膠內(nèi)酸堿指示劑發(fā)生反應(yīng)而出現(xiàn)硅膠顏色變化，間接監(jiān)測(cè)、報(bào)告MTB生長(zhǎng)代謝狀況，肉眼就能觀察結(jié)果。同時(shí)硅膠良好疏水性阻止水性溶液中的H+、OH-自由進(jìn)出，故培養(yǎng)基液體pH值對(duì)固載在硅橡膠內(nèi)酸堿指示劑無(wú)影響，完美地解決了一些可視化微量液體MTB藥敏檢測(cè)方法中將顏料或者指示劑直接加入培養(yǎng)基中、可能改變培養(yǎng)基的pH值而影響MTB生長(zhǎng)最終導(dǎo)致藥敏結(jié)果判斷錯(cuò)誤[19]。

本研究團(tuán)隊(duì)已利用裝置了變色硅膠的微孔板和培養(yǎng)管在前期測(cè)試了MTB臨床分離株對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素等抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)，證明新產(chǎn)品可靠性能[13，20];也測(cè)試MTB臨床分離株的PZA藥物敏感性，并確定了最佳檢測(cè)條件和檢測(cè)時(shí)間。MTB臨床分離株是實(shí)驗(yàn)室將含菌標(biāo)本培養(yǎng)分離篩選出的優(yōu)勢(shì)菌群、生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，用于PZA藥物檢測(cè)容易定量且能較快得藥敏結(jié)果，但MTB臨床分離菌株獲取過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)難以滿足臨床需要。本試驗(yàn)組根據(jù)前期利用微孔板變色硅膠顯色法對(duì)MTB臨床分離株P(guān)ZA藥敏試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，利用培養(yǎng)管變色硅膠顯色法直接對(duì)臨床涂陽(yáng)痰標(biāo)本中MTB進(jìn)行PZA藥敏檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：（1）最好選擇近期未接受抗結(jié)核藥物治療且分級(jí)計(jì)數(shù)3+以上痰標(biāo)本，因?yàn)?+以上痰標(biāo)本經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理可達(dá)到或接近10-3 mg/ml檢測(cè)終濃度[21]，雖然達(dá)不到0.25 mg/ml最佳檢測(cè)要求，但基本可以用來(lái)進(jìn)行直接測(cè)試。而分級(jí)計(jì)數(shù)在2+以上痰標(biāo)本或已接受抗結(jié)核治療半月以上的痰標(biāo)本，MTB活菌減少或者M(jìn)TB活力減弱，藥敏結(jié)果報(bào)告時(shí)間會(huì)相對(duì)延長(zhǎng)，如果用來(lái)直接進(jìn)行PZA藥物敏感性檢測(cè)，最好采用集菌方法。（2）在MIC為200 μg/ml判斷界值下，利用培養(yǎng)管色硅膠顯色法所檢測(cè)獲得藥敏結(jié)果與Bactec MGIT960基本一致，較真實(shí)反映臨床痰標(biāo)本中MTB的PZA藥物敏感性。（3）治療后痰標(biāo)本中MTB菌群狀態(tài)較為復(fù)雜，因?yàn)榛钚韵陆祷蚧罹鷶?shù)理較少，培養(yǎng)時(shí)間會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng)，硅膠顏色改變緩慢且不明顯，肉眼判斷較困難，可借助辨光檢測(cè)儀來(lái)觀察對(duì)照管和檢測(cè)管硅膠顏色變化，對(duì)顏色的細(xì)微變化做出分辨，有條件可以考慮聯(lián)合基因檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行pncA耐藥基因檢測(cè)來(lái)提高檢出率[22]。（4）因?yàn)镻ZA這種僅能殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌MTB的抗結(jié)核藥物，需要pH 5.7～5.9的酸性環(huán)境下才能發(fā)揮其最強(qiáng)殺菌能力[23]，而同樣條件下結(jié)核分枝桿菌MTB繁殖非常緩慢，因此培養(yǎng)基的調(diào)配要求相應(yīng)較高，本研究所用液體培養(yǎng)基成分與Bactec MGIT960培養(yǎng)基成分相似，保證了MTB在酸性培養(yǎng)基繁殖能力最優(yōu)化。（5）利用變色硅膠培養(yǎng)管對(duì)158例臨床涂陽(yáng)痰標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌菌型鑒定，結(jié)果鑒定與Bactec MGIT960完全一致，證明變色硅膠培養(yǎng)管在分枝桿菌培養(yǎng)及鑒定方面性能可靠。

本課題組利用變色硅膠培養(yǎng)管這一新型可視化MTB表型藥敏檢測(cè)工具直接檢測(cè)涂陽(yáng)痰標(biāo)本中MTB對(duì)PZA藥物敏感性，是為了提高檢測(cè)效率、根據(jù)結(jié)核病臨床快速藥敏試驗(yàn)需要進(jìn)行的研究，但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)極少數(shù)痰標(biāo)本中MTB藥敏檢測(cè)結(jié)果與Bactec MGIT960不一致，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行系統(tǒng)研究分析差異原因，可能需要在變色硅膠的指示劑離子負(fù)載量、硅膠孔徑分布等方面進(jìn)一步修正完善。變色硅膠培養(yǎng)管檢測(cè)技術(shù)原理科學(xué)、制作成本低，檢測(cè)結(jié)果易判讀且快速、精準(zhǔn)，適合結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2019-09-12） （本文編輯：張亮亮）