結(jié)核分枝桿菌Rv3872與Rv3873基因的克隆及重組真核表達載體的構(gòu)建

李雙雙+李木楠+關(guān)松磊+張文慧+張林波

摘 要：目的：克隆結(jié)核分枝桿菌Rv3872與Rv3873基因，并構(gòu)建Rv3872與Rv3873基因的重組真核表達載體，為研究這2個基因的功能奠定實驗基礎(chǔ)。方法：利用PCR技術(shù)克隆Rv3872與Rv3873基因序列，將其連接至pMD-18T載體，鑒定成功后將Rv3872與Rv3873序列插入真核表達載體pEGFP-C1，構(gòu)建重組pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表達載體，并進行質(zhì)粒PCR、雙酶切以及測序驗證。結(jié)果：經(jīng)測序比對后，Rv3872與Rv3873序列與GeneBank中公布的基因序列一致，重組載體構(gòu)建成功。結(jié)論：成功構(gòu)建重組pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表達載體。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；Rv3872；Rv3873；真核載體

中圖分類號 R446 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）08-0012-04

Abstract：Objective：Cloning of Mycobacterium tuberculosis Rv3872 and Rv3873 gene and constructing recombinant eukaryotic expression vector of Rv3872 and Rv3873 gene.Methods：The whole gene of Rv3872 and Rv3873 sequence were cloned by PCR，and then the gene were inserted into the pMD-18T，then inserted it into the pEGFP-C1 after successful validation，constructing the recombinant eukaryotic expression vectors of pEGFP-C1-Rv3872 and pEGFP-C1-Rv3873，and then the plasmid was validated by PCR and double enzyme digestion and sequencing.Resluts：Rv3872 and Rv3873 were consistent with the gene sequences published in GeneBank after sequencing，and the recombinant vector was successfully constructed.Conclusion：The recombinant eukaryotic expression vectors pEGFP-C1-Rv3872 and pEGFP-C1-Rv3873 were successfully constructed.

Key words：Mycobacterium tuberculosis；Rv3872；Rv3873；Eukaryotic vector

結(jié)核?。═uberculosis）是一種因感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）而引發(fā)的人畜共患傳染性疾病。2015年全世界新發(fā)結(jié)核病數(shù)量約為1 040萬例，據(jù)估計有140萬人死于結(jié)核病，還有40萬艾滋病毒感染者死于結(jié)核病[1]。結(jié)核分枝桿菌侵入機體后，主要由肺泡巨噬細胞吞噬、消化和摧毀，但結(jié)核分枝桿菌仍可以在這種惡劣的環(huán)境下生存和復(fù)制，其根本原因在于MTB可以調(diào)控宿主免疫、干擾細胞凋亡機制，抵御機體對病原菌的清除，進而在體內(nèi)復(fù)制和傳播。通過DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，弱毒性結(jié)核分枝桿菌與致病性結(jié)核分枝桿菌相比存在11個差異區(qū)（region of difference，RDs），與牛結(jié)核分枝桿菌相比存在16個RD區(qū)。RD1區(qū)是近年來人們研究的熱點，由RD1區(qū)分泌的蛋白有望成為結(jié)核病潛在的候選疫苗及診斷工具。Rv3872和Rv3873分別是PE和PPE家族成員，研究表明Rv3872與Rv3873編碼的PE35蛋白與PPE68蛋白在結(jié)核桿菌與巨噬細胞作用過程中發(fā)揮重要作用，能夠影響宿主細胞的功能[2，3]，但目前的研究尚不能完全闡述作用機制。本研究通過分子生物學(xué)手段，克隆Rv3872與Rv3873基因并構(gòu)建重組真核表達載體，為下一步研究Rv3872和Rv3873在胞內(nèi)的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和主要試劑 真核表達載體pEGFP-C1載體由廈門大學(xué)饋贈。限制性內(nèi)切酶KpnI、BamHI、E×Taq酶、T4 DNA ligase、10 X T4 DNA Ligase buffer、DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker（TaKaRa）；質(zhì)粒提取試劑盒（Gene Mark）；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 （Axygen公司）、PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Sangon Bitech）、pMD-18T載體（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 Rv3872、Rv3873基因的PCR擴增 根據(jù)Genbank中公布的Rv3872、Rv3873基因序列用Prime5.0進行引物設(shè)計，引物序列分別為P1 ：5′-ATGACAGAGCAGCAGTGGA-3′、P2：5′-CTATGCGAACATCCCAGT-3′、P3：5′-ATGCTGTGGACAGCAA-3′、P4：5′-ATGCTGTGGACAGCAA-3′，設(shè)計完成后送至上海生工生物工程有限公司合成。以人型H37Rv全基因組為模板，以P1與P2、P3與P4為引物擴增Rv3872、Rv3873基因，退火溫度為63.5℃、69℃，擴增體系為P1/P2、P3/P4各1μL，ExTaq mix 12.5μL，H37Rv全基因組1μL，ddH2O 9.5μL，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，53℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃再延伸l0min，4℃保溫l0min。反應(yīng)結(jié)束后，制備1%瓊脂糖凝膠，130V，電泳25min。

1.2.2 重組pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873載體的構(gòu)建及驗證 使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物與pMD-18T連接，連接體系為T4 DNA ligase（350U/μL）1μL、10XT4 DNA Ligase buffer 1μL、pMD-18T3μL、回收目的基因5μL，金屬浴16℃過夜連接，16h。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，轉(zhuǎn)化后將菌液涂布與含有氨芐抗性的LB固培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性單菌落置于含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，振蕩過夜。提取重組質(zhì)粒，并進行重組質(zhì)粒PCR及雙酶切驗證，驗證成功后送至上海生工測序。

1.2.3 重組pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表達載體的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)pEGFP-C1的載體圖譜，在目的基因上下游引物的5′端引入KpnⅠ和BamHⅠ，并加入與之相對應(yīng)的保護性堿基，具體引物序列設(shè)計為：P5：5′-CGGGGTACCATGGAAAAAATGTCACA-3′、P6：5′-CGCGGATCCCTATTCGGCGAAGACG、P7：5′-CGGGGTACCATGCTGTGGACAGCAA-3′、P8：5′-CGCGGATCCTCACCAGTCGTCCTCTTCG-3′，以測序成功的pMD-18T重組質(zhì)粒為模板，用帶酶切位點的引物進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同前，分別以P5與P6、P7與P8為引物擴增Rv3872和Rv3873基因，反應(yīng)完成后，用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒對目的條帶產(chǎn)物進行回收。對回收純化的PCR產(chǎn)物與pEGFP-C1載體分別用KpnI、BamHI雙酶切，純化回收。純化回收的基因與載體酶切產(chǎn)物連接，連接體系為T4 DNA ligase（350U/μL） 1μL、10XT4 DNA Ligase buffer 1μL、pEGFP-C1 3μL、回收目的基因5μL，金屬浴16℃過夜連接，16h。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，轉(zhuǎn)化后將菌液涂布與含有氨芐抗性的LB固培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性單菌落置于含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，振蕩過夜。提取重組質(zhì)粒，并進行重組質(zhì)粒PCR及雙酶切驗證，驗證成功后送至上海生工測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rv3872、Rv3873基因的PCR擴增結(jié)果 經(jīng)PCR擴增得到Rv3872、Rv3873基因，其片段長度分別為300bp、1 107bp左右，目的基因產(chǎn)物條帶清晰，條帶位置與預(yù)期位置相一致（圖1、2）。

2.2 重組pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873載體的構(gòu)建及驗證結(jié)果 對構(gòu)建的重組pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873載體進行質(zhì)粒PCR驗證和雙酶切驗證，結(jié)果表明質(zhì)粒PCR成功獲得長度分別為300bp、1107bp左右的片段，雙酶切產(chǎn)物有兩個條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3、4、5、6）。

2.3 重組pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表達載體的鑒定 利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒用KpnⅠ和BamHⅠ進行質(zhì)粒PCR及雙酶切驗證，發(fā)現(xiàn)與目的基因大小相一致，且條帶單一無雜帶，重組真核表達載體驗證成功后將其送至上海生工進行測序。對測序結(jié)果與Genbank中Rv3872、Rv3873公布的序列進行對比，經(jīng)DNAMAN Version5.2.2分析顯示，二者氨基酸序列同源性均為100%，說明重組pEGFP-C1-Rv3872、pEGFP-C1-Rv3873和pEGFP-C1-Rv3878真核表達載體構(gòu)建成功（圖7、8、9、10）。

3 討論

作為結(jié)核病的病原體，結(jié)核桿菌H37Rv全基因組共4 411 529bp，包括4 047個基因，其中4 018個為蛋白編碼基因[4]。MTB蛋白廣泛參與宿主細胞周期調(diào)控、各種代謝途徑、細胞運動與胞內(nèi)運輸、RNA加工與轉(zhuǎn)錄后修飾、防御機制與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、影響細胞結(jié)構(gòu)以及逃逸宿主免疫殺傷，此外還有一些未知的功能有待進一步研究[5，6]。

PE/PPE蛋白家族有多個成員涉及宿主免疫逃避[7-9]。其中PE35和PPE68分泌或與分枝桿菌細胞膜相關(guān)，參與介導(dǎo)宿主與病原體之間的相互作用[10，11]。有研究證明PE35和PPE68與分枝桿菌感染的細胞免疫應(yīng)答相關(guān)[12，13]。PE35和PPE68依賴TLR2受體誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞分泌IL-10和MCP-1并且降低IL-12p70的分泌，抵御宿主的清除[14-16]。pEGFP-C1載體為目前常用的真核細胞表達載體，含有PUC和SV40雙啟動子以及多克隆位點，保證外源基因能夠在大腸桿菌與哺乳動物細胞內(nèi)復(fù)制。pEGFP-C1載體上含有EGFP綠色熒光蛋白，其為GFP的突變體，其熒光強度為GFP的35倍，有利于外源基因在細胞內(nèi)的定位標(biāo)記[17]。

作為MTB潛在的毒力因子，MTB感染宿主細胞后，PE35與PPE68胞內(nèi)具體如何作用，目前尚不明確。為研究PE35與PPE68在宿主內(nèi)的作用方式，本實驗通過基因工程技術(shù)構(gòu)建pEGFP-C1-Rv3872、pEGFP-C1-Rv3873重組真核表達載體，經(jīng)質(zhì)粒PCR及質(zhì)粒雙酶切驗證，DNA測序比對，與GenBank上公布的基因序列完全相同，載體構(gòu)建成功，為進一步研究PE35、PPE68與宿主細胞的作用機制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]Organization W H.ZH TB：Global Report[EB/OL].http：//apps.who.int/tb/publications/global_report/zh/index.html.2016.

[2]Etna M P，Giacomini E，Pardini M，et al.Impact of Mycobacterium tuberculosis RD1-locus on human primary dendritic cell immune functions[J].Scientific Reports，2015，5：17078.

[3]Augenstreich J，Arbues A，Simeone R，et al.ESX-1 and phthiocerol dimycocerosates of Mycobacterium tuberculosis act in concert to cause phagosomal rupture and host cell apoptosis[J].Cellular Microbiology，2017.

[4]Jocelyne M.Lew，Adamandia Kapopoulou，Louis M.Jones，et al.TubercuList-10 years after[J].Tuberculosis，2011，91（1）：1-7.

[5]吳雪瓊，吳長有.結(jié)核病免疫學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2016.

[6]Anand P，Sankaran S，Mukherjee S，et al.Structural Annotation of Mycobacterium tuberculosis Proteome[J].Microbiology Spectrum，2014，2（2）：1551-1564.

[7]Liu Z，Shuang Q，Li L，et al.Identification of Novel RD1 Antigens and Their Combinations for Diagnosis of Sputum Smear?/Culture+ TB Patients[J].Biomed Research International，2016，2016（1）：1-10.

[8]Ganguly P，Sharma S，Sharma P，et al.RD-1 Region of Mycobacterium tuberculosis：Protein Secretion and Virulence[J].Research Gate，2015，2：78-83.

[9]Sharifipour E，Nasiri M J，F(xiàn)arnia P，et al.Evaluation of molecular diversity of Mycobacterium tuberculosis strains by polymorphisms in RD regions[J].Mycobacterial Diseases，2014.

[10]王輝.分枝桿菌PPE38蛋白與宿主相互作用機制的研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2014.

[11]鄧萬燕.結(jié)核分枝桿菌PE/PPE家族蛋白的性質(zhì)及其在與宿主細胞相互作用中的功能[D].重慶：西南大學(xué)，2015.

[12]彭哲.結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)研究進展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（1）：89-91.

[13]Jiang Y，Wei J，Liu H，et al.Polymorphisms in the PE35 and PPE68 antigens in Mycobacterium tuberculosis strains may affect strain virulence and reflect ongoing immune evasion[J].Molecular Medicine Reports，2016，13（1）：947.

[14]Tiwari B，Soory A，Raghunand T R.An immunomodulatory role for the Mycobacterium tuberculosis，region of difference 1 locus proteins PE35（Rv3872）and PPE68 （Rv3873）[J].Febs Journal，2014，281（6）：1556–1570.

[15]喻曉雯.結(jié)核分枝桿菌RD1蛋白PE35經(jīng)TLR2干擾IL-1β信號傳遞[D].重慶：西南大學(xué)，2014.

[16]Ganguly N，Sharma P.Mycobacterium tuberculosis RD-1 Secreted Antigens as Protective and Risk Factors for Tuberculosis[M]//Understanding Tuberculosis-Deciphering the Secret Life of the Bacilli.InTech，2012.

[17]張松，陳敏，黃淑玲，等.pEGFP-C1-HSP27真核表達載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胰腺癌SW1990細胞株的篩選[J].中華胰腺病雜志，2012，12（3）：177-180. （責(zé)編：張宏民）