應(yīng)用液氮損傷建立兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型的研究

李枚娟，林杉鐿，王預(yù)立，路懷志，王焱

急性冠脈綜合征（ACS）患者可表現(xiàn)為不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死，研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病主要原因?yàn)檠芮粌?nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂及血栓形成[1]。斑塊形成起源于血管內(nèi)皮，內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、脂質(zhì)浸潤(rùn)、平滑肌細(xì)胞增殖、泡沫細(xì)胞形成最終發(fā)展成粥樣硬化斑塊。若這些斑塊具有較大的脂質(zhì)核心、薄的纖維帽和大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，即形成所謂的“易損斑塊”。易損斑塊肩區(qū)破裂最終導(dǎo)致血栓形成[2]。因此，對(duì)易損斑塊深入研究對(duì)心血管疾病的治療具有重要臨床意義。但現(xiàn)今缺乏供研究的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物模型，故本實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用液氮溫控氣體損傷兔頸動(dòng)脈血管內(nèi)皮的方法形成易損斑塊，建立理想的動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組雄性新西蘭大白兔24只，購(gòu)于閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成三組，每組8只：空白對(duì)照組、假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組。假手術(shù)組、手術(shù)組高脂飼料喂養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)組在手術(shù)后給予液氮溫控氣體損傷兔左頸總動(dòng)脈內(nèi)膜，并繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)3個(gè)月；假手術(shù)組僅手術(shù)操作，術(shù)后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)3個(gè)月；空白對(duì)照組不行任何操作，給與普通飼料喂養(yǎng)3個(gè)月。

1.2 試劑與藥品高脂飼料（1%膽固醇+8%黃油+10%蛋黃粉+兔基礎(chǔ)飼料）（吳氏動(dòng)物），醫(yī)用液氮，蘇木素染液（BOSTER，AR11800-1）；伊紅染色液(BOSTER ，AR11800-2）；超凈高級(jí)封片膠（BASO，YZB）；Scott藍(lán)化液（Solarbio，G1865），PBS磷酸鹽緩沖液，戊巴比妥鈉（烏拉坦），魯塞爾蝰蛇毒（鷹潭志遠(yuǎn)蛇業(yè)科技有限公司），兔IL-2 Elisa試劑盒、兔IL-10 Elisa試劑盒、兔TNF-αElisa試劑盒（上海士峰科技有限公司），組胺（上海源葉生物科技有限公司，B24434）。

1.3 器械與設(shè)備液氮治療儀（新鄉(xiāng)新亞低溫容器有限責(zé)任公司），藥品冷藏柜（山東博科生物，BYC-310），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS-CX41），石蠟切片機(jī)（伯納，BQ-318D），電熱鼓風(fēng)干燥箱（恒科學(xué)儀器有限公司，DHG-9070A）。

1.4 液氮溫控氣體損傷兔左頸總動(dòng)脈內(nèi)膜

1.4.1 低溫氣體輸出裝置液氮治療儀、一次性使用靜脈輸液針。使用方法：阻塞A口，腔室B內(nèi)壓升高，液氮由中央管道內(nèi)氣化為低溫氣體并流出，經(jīng)液氮儀和輸液針連接處D，由針頭C處噴出，噴出氣體溫度為-55℃至-65℃。

1.4.2 頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷①麻醉及備皮：實(shí)驗(yàn)組兔麻醉處理（耳緣靜脈注射烏拉坦1 g/kg），固定于操作臺(tái)，備皮。②分離左頸總動(dòng)脈：做頸正中切口，分離皮下組織和肌肉組織，暴露左頸總動(dòng)脈。③置留輸液針：動(dòng)脈夾夾閉左頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和近心端后使用1 ml注射器針頭于遠(yuǎn)心端刺入血管，抽出血液后沖洗。用于留置的5號(hào)靜脈輸液針由近心端平行插入血管。④溫控氣體損傷內(nèi)膜：加入200 ml液氮于液氮治療儀后快速連接留置針，如圖1所示使用，低溫氣體經(jīng)C口作用于動(dòng)脈內(nèi)膜后可經(jīng)遠(yuǎn)心端噴出，作用時(shí)間5 s，反復(fù)3次。⑤后續(xù)處理：動(dòng)脈管腔沖洗后撤去遠(yuǎn)心端動(dòng)脈夾，濕紗布?jí)浩戎寡? min，待出血停止后撤去近心端動(dòng)脈夾，繼續(xù)壓迫止血5 min，縫合傷口。假手術(shù)組僅行手術(shù)操作，僅分離左頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行低溫氣體損傷動(dòng)脈內(nèi)膜，其余均同實(shí)驗(yàn)組。

1.5 藥物觸發(fā)斑塊易損在Constantinides[3]等的指導(dǎo)下，3組動(dòng)物均于處死前48 h藥物觸發(fā)1次：腹膜下注射魯塞爾蝰蛇毒0.15 mg/kg，半小時(shí)后組胺經(jīng)耳緣靜脈注射0.02 mg/kg；于處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前24 h再次觸發(fā)。

1.6 獲取標(biāo)本及其處理術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)3月（第二次藥物觸發(fā)斑塊易損后24 h），3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均經(jīng)耳緣靜脈注射過量烏拉坦處死，分離左頸總動(dòng)脈取約5 cm置于福爾馬林溶液內(nèi)。固定1周后，取出組織流水沖洗數(shù)小時(shí)，經(jīng)70%、80%、90%各級(jí)乙醇溶液脫水，純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ 15 min、Ⅱ 15 min（至透明為止）。放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50～60 min。石蠟包埋，切片。將石蠟切片進(jìn)行烤片，然后脫蠟，水化。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返藍(lán)液返藍(lán)15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片后應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查斑塊的組織形態(tài)，確認(rèn)粥樣硬化斑塊形成。

圖1 低溫氣體輸出裝置

動(dòng)物處死前，采血，于室溫自然凝固15 min后，離心20 min（3000 轉(zhuǎn)/min），仔細(xì)收集上清，使用Elisa試劑盒經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、顯色、終止，分別測(cè)定IL-2、IL-10、TNF-α在血清中的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值士標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組因?yàn)趵孤樽磉^量死亡1只，術(shù)后卒中死亡1只，存活6只；假手術(shù)組因術(shù)后感染死亡1只，存活7只；空白對(duì)照組8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活。

術(shù)后，各組取頸總動(dòng)脈包埋、切片，經(jīng)HE染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察頸總動(dòng)脈組織形態(tài)變化。空白對(duì)照組可見內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)、完整，彈力膜清晰完好，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，內(nèi)膜下無脂質(zhì)沉積，未見斑塊形成（圖2A）。假手術(shù)組可見血管內(nèi)膜局部增厚，提示存在內(nèi)皮增生，未見明顯易損斑塊形成（圖2B）。實(shí)驗(yàn)組可見內(nèi)皮廣泛增生、彈力纖維破壞、連續(xù)性中斷，大量泡沫細(xì)胞形成，斑塊破裂、堵塞血管，提示易損斑塊形成（圖2C、2D、2E）。

2.2 血清學(xué)指標(biāo)三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后采血經(jīng)Elisa檢測(cè)顯示，空白對(duì)照組與假手術(shù)組相比，炎癥因子IL-2、IL-10、TNF-α的表達(dá)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而實(shí)驗(yàn)組炎癥因子IL-2、IL-10、TNF-α表達(dá)較假手術(shù)組和空白對(duì)照組均有明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表1。

圖1 低溫氣體輸出裝置

表1 血清IL-2、IL-10、TNF-α表達(dá)水平（±s）

表1 血清IL-2、IL-10、TNF-α表達(dá)水平（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，aP＜0.05；與假手術(shù)組相比，bP＜0.05

組別 IL-2（ng/L） IL-10（ng/L） TNF-α（ng/L）空白對(duì)照組 2.67±0.58 76.85±18.06 116.10±11.11假手術(shù)組 2.81±0.35 81.75±15.46 124.15±16.83實(shí)驗(yàn)組 4.55±0.84ab 147.69±33.03ab 207.07±46.78ab

3 討論

急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者由于不穩(wěn)定的易損斑塊破裂引起血栓引起[3]，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。臨床上，可利用血管內(nèi)超聲、光學(xué)相干斷層成像、冠狀動(dòng)脈多層CT、MRI及各種炎癥指標(biāo)水平等檢測(cè)手段來評(píng)估易損斑塊[4,5]，但現(xiàn)有動(dòng)物模型較為局限，仍然缺乏可靠的動(dòng)物模型來還原動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊病理生理過程[6]，因此，建立更理想的易損斑塊動(dòng)物模型具有重要的意義。

本研究通過模擬人類心血管疾病的發(fā)生過程，建立兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，并結(jié)合應(yīng)用藥物觸發(fā)斑塊不穩(wěn)定[7,8]。病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組可見內(nèi)皮廣泛增生、彈力纖維破壞、連續(xù)性中斷，大量泡沫細(xì)胞形成，并且部分血管出現(xiàn)斑塊破裂、血管堵塞。與假手術(shù)組及空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組可見明顯的易損斑塊形成。也證明基于斑塊形成的損傷反應(yīng)學(xué)說、脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說[9]的本研究可成功建立同人體較相符的易損斑塊模型。同時(shí)，Elisa檢測(cè)三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清炎癥因子IL-2、IL-10、TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照組及假手術(shù)組血清炎癥因子IL-2、IL-10、及TNF-α均明顯提高，提示，炎癥細(xì)胞因子在動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊形成過程中可能發(fā)揮重要作用。

兔動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過程及脂質(zhì)代謝與人類相似[10]，故本實(shí)驗(yàn)利用兔建立了一種新的用于易損斑塊研究的動(dòng)物模型。且該模型炎癥細(xì)胞因子水平明顯升高，也符合動(dòng)脈粥樣硬化的脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說及炎癥反應(yīng)學(xué)說。但本研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例數(shù)相對(duì)較少，且未對(duì)比術(shù)前、術(shù)后炎癥因子指標(biāo)，今后可繼續(xù)加大樣本量、行多指標(biāo)的研究來驗(yàn)證該模型的可靠性，為臨床研究提供良好的動(dòng)物模型。