c-Jun抑制劑對大鼠心肌纖維化抑制作用

鮑宏剛，趙冰，徐志勇，薛麗

心房顫動（房顫，AF）是臨床上最常見的心律失常，隨著世界人口老齡化趨勢的增加，AF的發(fā)病率也有逐年增加的趨勢，因此對于AF發(fā)病機制的研究一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點。而心房纖維化是AF時心房重構(gòu)的重要表現(xiàn)形式，在AF發(fā)生和維持中的起到重要作用[1,2]。研究指出AF時血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）含量的升高可參與心房纖維化的形成[3,4]，AngⅡ可通過與其Ⅰ型受體相結(jié)合，激活絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKS）中的c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種生物細(xì)胞學(xué)效應(yīng)如：炎癥、凋亡、生長及分化等[5-7]，該通路的激活可能參與心房纖維化[8,9]的形成。因此我們推測抑制JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，可能起到改善心房纖維化的作用。故本研究參考Zhang等[10]方法采用皮下多點注射大劑量鹽酸異丙基腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠心房纖維化模型，觀察JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑SP600125對大鼠心房纖維化的影響。

1 資料和方法

1.1 實驗動物SPF級雄性Waster大鼠32只，體質(zhì)量為（180±20）g。購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心（動物使用許可證號：2007000524909）。

隨機數(shù)字表法等分為4組：對照組、二甲基亞砜（DMSO）組、鹽酸異丙腎上腺素（ISO）[5mg/（kg·d）]組（模型組）、ISO[5 mg/（kg·d）]+SP600125[10 mg/（kg·d）]組（抑制劑組）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立參考Zhang等[10]方法采用皮下多點注射大劑量鹽酸異丙基腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠心房纖維化模型，模型組和抑制劑組大鼠按5 mg/kg體質(zhì)量腹部皮下多點注射ISO（購自上海禾豐制藥有限公司），抑制劑組參照金鑫等[11]方法于ISO注射前1 h按10 mg/kg體質(zhì)量給予SP600125溶液（SP600125溶于DMSO液中配成濃度為4 mg/ml的溶液）尾靜脈注射（SP600125及DMSO溶液均購自美國sigma公司），1/d，連續(xù)7 d。而對照組、DMSO組給予等量生理鹽水多點腹部皮下注射，而DMSO組尾靜脈注射與抑制劑組等劑量的DMSO，以上各組處理，1/d，連續(xù)7 d。各組大鼠于7 d后脫臼處死。

1.2.2 取材及標(biāo)本處理各組大鼠脫臼處死后立即開胸、取出心臟，沿心臟長軸用眼科剪剪開大鼠心臟，取心房組織置于10%中性甲醛緩沖液中固定24 h后，石蠟包埋，連續(xù)切片4張,切片厚度4 μm， 分別用于H-E染色、Masson染色、p-JNK1/2/3、p-c-Jun免疫組化染色。剩余心房組織取出后立即置-80℃冰箱中冷凍保存，用于放免法檢測AngⅡ的含量。

1.2.3 AngⅡ含量的測定取出100 mg凍存的心房肌組織，低溫研磨并按放射免疫試劑盒（購自北京北方生物技術(shù)研究所）說明書要求劑量加入兩種酶抑制劑（二巰基丙醇、8-羥基喹啉硫酸鹽），而后加入pH值為7.4，濃度0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）液1 ml，離心機3580 g離心20 min后取上清液0.2 ml送往蘭州軍區(qū)總醫(yī)院放射免疫科檢測AngⅡ濃度（pg/ml）。

1.2.4 大鼠心肌組織病理改變及CVF計算心肌石蠟組織切片HE、Masson染色后，光鏡下（×400）觀察各組HE染色中心肌組織病理改變及纖維化情況并攝片，Masson染色后每張切片選取4個不重疊無血管視野（×400），采用Image-Pro plus 5.0圖像掃描軟件進行圖像分析，計算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），并以此作為心肌纖維化程度的量化指標(biāo)。CVF（%）=膠原面積/全視野面積×100%。

1.2.5 p-JNK1/2/3、p-c-Jun含量的測定采用免疫組化SP法（SP試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司）檢測大鼠心肌組織中p-JNK1/2/3、P-c-Jun的含量。具體步驟如下：將心肌組織切片置于68℃烤箱中40 min，脫蠟、脫水；蒸餾水沖洗2 min×3次；高壓鍋抗原修復(fù)；蒸餾水沖洗3 min×3次；3%H2O2去離子水37℃孵育20 min；PBS沖洗3 min×3次；山羊血清工作液封閉，37℃孵育15 min，傾去勿洗；滴加1:100兔抗鼠一抗工作液（分別為p-JNK1/2/3多克隆抗體、p-c-Jun，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司）37℃孵育2 h（并用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；PBS沖洗3 min×3次；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗，37℃孵育15～20 min，PBS沖洗3 min×3；然后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育20 min，PBS沖洗3 min×3；室溫下DAB（購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司）顯色，鏡下控制顯色時間；自來水充分沖洗；復(fù)染；脫水；透明；中性樹脂封片；鏡檢。每張切片中隨機各取4個無血管視野（×400），利用Image-Pro plus 5.0圖像掃描軟件進行圖像分析，測定每個視野下陽性物質(zhì)的平均光密度值，Mean density =累積光密度值（IOD SUM）/面積（area）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，并采用Pearson積差進行相關(guān)性分析，檢驗水平（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 模型建立成功結(jié)果適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，參考Zhang等[10]方法采用皮下多點注射大劑量鹽酸異丙基腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠心房纖維化模型，模型組大鼠按5 mg/kg體質(zhì)量腹部皮下多點注射ISO（購自上海禾豐制藥有限公司），1/d，連續(xù)7 d。而對照組給予等量生理鹽水多點腹部皮下注射，1/d，連續(xù)7 d。各組大鼠于7 d后脫臼處死，通過HE染色確定心肌纖維化程度并與對照組比較，以確定造模成功。行正式實驗前均行預(yù)實驗，證實造模方法可行后方開始正式試驗。

2.2 大鼠心房肌組織中AngⅡ的含量結(jié)果顯示：對照組[（68.51±10.76）pg/L]、DMSO組[（71.47±11.49）pg/L] 中AngⅡ的含量較低，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）、而干預(yù)組[（185.32±54.85）pg/L] 和模型組[（211.25±49.49）pg/L]中AngⅡ的含量較對照組和DMSO組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠心肌組織纖維化程度及CVF

2.3.1 H-E染色光鏡下H-E染色正常心肌組織的細(xì)胞核被染成藍色，細(xì)胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞均呈紅色。圖中可見對照組、DMSO組心肌纖維排列規(guī)則而清晰；而模型組肌纖維扭曲腫脹、斷裂、排列紊亂、細(xì)胞外間隙明顯增寬，纖維化程度明顯；抑制劑組纖維化程度較模型組明顯減輕（圖1）。

圖1 各組大鼠心肌間質(zhì)纖維化H-E染色結(jié)果（HE×400）

2.3.2 Masson染色和CVFMasson染色時細(xì)胞質(zhì)、心肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍色，心房肌組織間質(zhì)膠原成分被染成綠色（圖2）。Masson染色后每采用Image-Pro plus 5.0圖像掃描軟件計算CVF。結(jié)果示：對照組[（6.842±1.674）%]、DMSO組[（7.108±1.343）%]和抑制劑組[（7.861±1.867）%]中無明顯差別（P＞0.05），而模型組[（29.485±9.966）%]較對照組、DMSO組、抑制劑組升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠心肌間質(zhì)纖維化Masson染色結(jié)果（Masson ×400）

2.4 大鼠心房肌組織中p-JNK1/2/3和p-c-Jun的免疫組化染色及半定量結(jié)果如圖3、4所示：正常心肌細(xì)胞的p-JNK1/2/3和p-c-Jun分布于心肌細(xì)胞胞漿中，免疫組化染色陽性呈棕黃色。各組中兩者半定量分析結(jié)果（表1）：對照組[分別為（0.151±0.016）；（0.163±0.022）]與DMSO[分別為（0.154±0.021）；（0.164±0.024）]組中兩者的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；模型組[分別為（0.202±0.025）；（0.254±0.044）]較空白對照組與DMSO組均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；抑制劑組[分別為（0.160±0.025）；（0.168±0.024）]中兩者的含量與空白對照組和DMSO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與模型組、QUE組相比含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠心肌組織中p-JNK1/2/3免疫組化染色結(jié)果（免疫組化×400）

圖4 各組大鼠心肌組織中p-c-Jun免疫組化染色結(jié)果（免疫組化 ×400）

表1 各組心房肌組織中p-JNK1/2/3、 p-c-Jun及CVF檢測結(jié)果（±s）

表1 各組心房肌組織中p-JNK1/2/3、 p-c-Jun及CVF檢測結(jié)果（±s）

注：A、B、C、D分別代表空白對照組、DMSO組、模型組、抑制劑組。p-JNK1/2/3=磷酸化c-Jun氨基末端激酶1/2/3； p-c-Jun =磷酸化c-Jun蛋白；CVF=膠原容積分?jǐn)?shù)。與A組比較，aP＞0.05；與B組相比較，bP＜0.01；與C組相比較，cP＜0.05

組別 大鼠（只） p-JNK1/2/3 c-Jun CVF A 8 0.151±0.016 0.163±0.022 （6.842±1.674）%B 8 0.154±0.021a 0.164±0.024a （7.108±1.343）% a C 8 0.202±0.025b 0.254±0.044b （29.485±9.966）%b D 8 0.160±0.025bc 0.168±0.024bc （7.861±1.867）% bc

2.5 相關(guān)性分析采用Pearson積差相關(guān)性分析，p-JNK1/2/3和p-c-Jun的含量與心房纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.881，P＜0.01；r=0.862，P＜0.01）。

3 討論

AF是臨床上最常見的心律失常，具有很高的致殘率和致死率，其發(fā)病機制的研究一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點，AF的發(fā)生與維持主要與心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)與電重構(gòu)有著密切的關(guān)系，而心房纖維化是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要表現(xiàn)形式，因此抑制心房纖維化對于AF的預(yù)防和治療具有重要意義。研究[3,4]表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中的主要效應(yīng)分子--AngⅡ可參與心房纖維化的形成，進一步研究也[5-7]證實AngⅡ?qū)е滦募±w維化的形成主要與激活JNK信號通路有關(guān)，而JNK通路作為真核生物中已明確的四條MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2通路、JNK通路、P38通路、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5通路）中重要的的通路之一[12]，可參與誘導(dǎo)產(chǎn)生多種生物細(xì)胞學(xué)效應(yīng)如：炎癥、凋亡、生長及分化等。另有研究指出AF時伴有JNK信號通路的激活，并且該通路參與了AF時心房纖維化的形成[8,9]。既往研究中可以看出AngⅡ可通過激活JNK信號通路，導(dǎo)致心房纖維化，鮑宏剛等[13]研究已表明谷氨酰胺可通過抑制JNK信號通路改善大鼠心房纖維化，但JNK信號通路的直接抑制劑SP600125是否可通過抑制JNK信號通路的激活而起到改善AngⅡ誘導(dǎo)的心房纖維化尚未見相關(guān)報道，這將為臨床上AF的預(yù)防或治療提供新的思路。由于該實驗樣本量偏小，檢驗指標(biāo)采用的為半定量分析方法，可能數(shù)據(jù)有一定偏差，但實驗結(jié)果表明，差異顯著。

本實驗中大鼠大劑量皮下注射ISO 7 d后發(fā)現(xiàn)，模型組心肌組織中AngⅡ含量與對照組和DMSO組相比均增高，p-JNK1/2/3及p-c-Jun的表達增加，并且在模型組出現(xiàn)了明顯的心房纖維化。表明注射ISO后，心肌組織中AngⅡ的含量升高并激活了JNK信號通路，使通路中關(guān)鍵蛋白p-JNK1/2/3及p-c-Jun的表達增加，促使大鼠心房肌纖維化的形成。同時說明了溶劑DMSO對JNK信號通路及大鼠心房纖維化無明顯影響。

而抑制劑組給予JNK通路抑制SP600125尾靜脈注射后心肌組織中p-JNK1/2/3及p-c-Jun的表達較模型組減少，心肌纖維化程度明顯減輕。表明SP600125可通過抑制JNK信號通路，有效減輕AngⅡ誘發(fā)的大鼠心肌纖維化。

綜上所述， 大劑量皮下注射ISO后可激活RAS系統(tǒng)，使心房肌組織中AngⅡ含量升高，后者可通過激活JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘發(fā)大鼠心房纖維化，而JNK通路抑制SP600125可通過抑制JNK通路的激活起到改善ISO所致大鼠心房纖維化的作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。但由于該實驗樣本量偏小，檢驗指標(biāo)采用的為半定量分析方法，可能數(shù)據(jù)有一定偏差。