HIF-1α在七氟醚后處理減輕大鼠心肌缺血再灌注致線粒體功能損傷中的作用研究

楊龍，吳建江，王江，鄭宏

缺血/再灌注損傷（I/RI）是圍術(shù)期心臟不良事件發(fā)生和死亡的重要原因，有效降低圍術(shù)期心肌缺血再灌注損傷是多學(xué)科亟待解決的問題。七氟醚因具有誘導(dǎo)平穩(wěn)、蘇醒迅速等獨(dú)特的藥理學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)研究，同時也是圍術(shù)期極具希望的對抗心肌缺血再灌注損傷的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是參與低氧反應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，主要通過調(diào)控下游低氧敏感基因的表達(dá)使細(xì)胞在低氧環(huán)境下得以生存[1]，被認(rèn)為是心肌內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的起始因子，也是介導(dǎo)七氟醚后處理發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵靶標(biāo)[2]。在心肌發(fā)生缺血再灌注損傷的情況下七氟醚后處理能夠通過穩(wěn)定線粒體功能發(fā)揮保護(hù)作用[3,4]。但是HIF-1α在七氟醚后處理減輕心肌缺血再灌注損傷中對線粒體功能有何影響尚不清楚。本研究旨在探討HIF-1α在七氟醚后處理減輕大鼠心肌缺血再灌注致線粒體功能損傷中的作用，為圍術(shù)期應(yīng)用七氟醚后處理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 離體心臟灌注模型的制備清潔級健康成年雄性SD大鼠88只，體重250～300 g，16～20周齡，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。參照文獻(xiàn)[5]建立Langendorff離體心臟灌注模型：腹腔注射250 U/kg肝素抗凝和1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后仰臥位固定，消毒胸腹部皮膚后沿肋緣下橫向剪開腹前壁，再沿腹中線向頭端剪至劍突，切開膈肌后暴露胸腔，分離縱隔前組織，暴露心臟及心底部大血管，于心臟根部快速剪下心臟，保留主動脈3～4 mm，即刻放入預(yù)冷的4℃ K-H液中。使用眼科鑷夾住主動脈兩側(cè)，4號手術(shù)線固定心臟于Langendorff灌注針上，用預(yù)先平衡的37℃ K-H液行主動脈逆行灌注。將肺動脈及左心耳剪開，以自制橡膠球囊沿左心耳經(jīng)二尖瓣口插入左心室，連接Powerlab/8SP生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)壓力換能器系統(tǒng)，維持灌注壓力60～70 mmHg，調(diào)節(jié)球囊大小和位置，保持左心室舒張末期壓（LVEDP） 0～10 mmHg。上述步驟2 min內(nèi)完成。納入標(biāo)準(zhǔn)：離體心臟平衡20 min后，心衰（HR）＞250 次/min、左心室舒張最低壓（LVDP）＞80 mmHg、室性早搏＜2 次/min。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將88個離體灌注心臟分為4組（n=22），對照組（C組）、缺血再灌注組（I/R組）、七氟醚后處理組（Spost組）和HIF-1α抑制劑2ME2組（2ME2組）。C組持續(xù)灌注K-H液180 min；I/R組平衡20 min，缺血40 min，再灌注120 min；在缺血末復(fù)灌即刻，Spost組灌注經(jīng)2.4%七氟醚（批號：67081，Maruishi Pharmaceutical公司，日本）飽和的K-H液15 min后續(xù)灌正常K-H液105 min；2ME2組復(fù)灌含2ME2（批號：S1233，Selleck公司，美國）+2.4%七氟醚飽和的K-H液15 min后續(xù)灌正常K-H液105 min。

1.3 方法

1.3.1 采用漢莎氧電極法測定線粒體State3、RCR參照文獻(xiàn)[6]，提取心肌線粒體后，按照Bradford蛋白濃度定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）說明進(jìn)行線粒體蛋白定量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。參照文獻(xiàn)[7]，采用漢莎氧電極（英國，Hansatech Ltd公司）在配有磁力攪拌溫控測氧池內(nèi)測定（3 ml）線粒體3態(tài)、4態(tài)呼吸。反應(yīng)液總體積為1000 μl，溫度37℃，預(yù)先加入900 μl線粒體呼吸測定介質(zhì)，平衡15 min后加入蛋白定量終濃度為1 mg/ml的線粒體懸液50 μl，記錄20～30 s氧耗曲線，曲線基本平穩(wěn)后，加入5 mmol/L琥珀酸10 μl和2 μmol/L魚藤酮1 μl，進(jìn)入4態(tài)呼吸，記錄1 min，再加入100 μmol/L ADP 9 μl，進(jìn)入3態(tài)呼吸；記錄耗氧曲線變化情況，當(dāng)ADP全部磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP后，線粒體進(jìn)入4態(tài)呼吸。RCR=3態(tài)呼吸氧耗速率÷4態(tài)呼吸氧耗速率。

1.3.2 ATP含量采用ATP檢測試劑盒（S0026，碧云天，中國）測定ATP含量，參照文獻(xiàn)[8]，20毫克心肌組織加入200 μl裂解液，然后用玻璃勻漿器充分勻漿確保組織被完全裂解。裂解后4℃12 000 g離心5 min，取上清用于后續(xù)的測定。100微升ATP檢測工作液加到檢測孔，室溫放置3～5 min后各孔再加入20 μl樣品，至少間隔2 s后用多功能酶標(biāo)儀測定RLU值。

1.3.3 膜電位檢測采用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）測定膜電位（C2006，碧云天，中國）參照文獻(xiàn)[9]，將10 μl純化的線粒體和90 μl稀釋5倍的JC-1染色溶液加入到96孔板的每個孔中并混勻，在多功能酶標(biāo)儀上以525 nm激發(fā)光/590 nm發(fā)射光測量JC-1聚合物熒光，490 nm激發(fā)光/530 nm發(fā)射光測量JC-1單體熒光，分別代表紅色熒光和綠色熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)表示為紅/綠熒光單位（R/G FLU）的比率。

1.3.4 心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)再灌注結(jié)束時隨機(jī)取4個心臟，各組隨機(jī)取1×1×1 mm左室心肌，經(jīng)固定、漂洗、脫水、包埋、切片及染色后使用H-600型透射電鏡（×10 000，Hitachi公司，日本）觀察心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.3.5 Western blot法檢測HIF-1α表達(dá)復(fù)灌末隨機(jī)取6個心臟，剪取左心室心肌組織，即刻置于液氮保存。提取心肌組織總蛋白，采用組織裂解液裂解，取樣品30 μg，在SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)中電泳、轉(zhuǎn)膜，于37℃封閉2 h，加入鼠抗HIF-1α單克隆抗體（批號：ab463，Sigma公司，美國）和山羊抗GAPDH多克隆抗體（稀釋度 1:1000，Sigma公司，美國），4℃孵育過夜，TBST液洗膜后加入二抗抗鼠IgG-HRP（批號：A4416，Sigma公司，美國）和抗山羊IgG-HRP（稀釋度1:5000，Sigma公司，美國）室溫孵育1 h。ECL顯色成像，應(yīng)用Quantity One圖像分析系統(tǒng)對目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體呼吸功能與I/R組比較，Spost組明顯改善線粒體3態(tài)呼吸、RCR （P均＜0.05）；2ME2組與I/R組線粒體呼吸功能指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（表1）。

表1 四組心肌細(xì)胞線粒體State3（nmol/min·mg pro）及RCR的比較（n=12，±s）

表1 四組心肌細(xì)胞線粒體State3（nmol/min·mg pro）及RCR的比較（n=12，±s）

注：與C組相比，aP＜0.05 ；與I/R相比，bP＜0.05；與Spost相比，cP＜0.05；State3：3態(tài)呼吸；RCR：呼吸控制比

指標(biāo) C組 I/R組 Spost組 2ME2組State3 146±7 70±6a 121±7ab 71±5ac RCR 2.24±0.15 1.12±0.08a 1.88±0.07ab 1.13±0.07ac

2.2 ATP含量測定與I/R組比較，Spost組ATP含量升高（P＜0.05），2ME2組ATP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 各組ATP含量比較

2.3 線粒體膜電位與I/R組比較，Spost組膜電位升高（P＜0.05），2ME2組膜電位差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組線粒體膜電位比較

2.4 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)與I/R組相比，Spost組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損較輕，肌絲排列尚整齊；大多線粒體形態(tài)完整，部分線粒體輕度腫脹，但未見溶解破裂；2ME2組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損程度與I/R組一致（圖3）。

2.5 HIF-1α蛋白表達(dá)變化再灌注末Spost組缺血區(qū)心肌組織HIF-1α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與I/R組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖3 電鏡下各組心肌超微結(jié)構(gòu)（x10000）

3 討論

本研究采用Langendofff離體灌注模型[5]，排除了體液、神經(jīng)等因素的影響，便于觀察藥物對心臟的直接作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠離體心臟缺血再灌注后心肌超微結(jié)構(gòu)破壞，提示離體心臟缺血再灌注損傷模型制備成功。參照文獻(xiàn)[10]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇2.4%七氟醚飽和K-H液于缺血末至再灌注初15 min進(jìn)行灌注。結(jié)果表明，Spost組心肌超微結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于I/R組，這與Qi等[11]研究結(jié)果一致，表明七氟醚后處理減輕了大鼠離體心臟缺血再灌注損傷。

圖4 各組HIF-1α蛋白表達(dá)

本研究中I/R組線粒體State3、RCR、ATP、膜電位明顯降低，但Spost組State3、RCR、ATP、膜電位明顯優(yōu)于I/R組。結(jié)果說明心肌缺血再灌注導(dǎo)致線粒體功能受損而Spos能夠改善粒體呼吸功能，增加缺血心肌能量供應(yīng)，這可能歸功于Spost能夠有效維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整[12,13]。但是有學(xué)者認(rèn)為Spost可以改善缺血再灌注時線粒體功能，關(guān)鍵在于Spost能夠促進(jìn)線粒體自噬，減輕氧化應(yīng)激[4]。本研究認(rèn)為線粒體主要功能是通過電子傳遞鏈氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，只有改善了線粒體呼吸功能，才能確保缺血心肌的能量供應(yīng)。因?yàn)榫€粒體是真核生物細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化生成能量的場所，而State3、RCR是反映線粒體功能的靈敏指標(biāo)，ATP是反映線粒體功能的直接指標(biāo)，膜電位是反映線粒體完整性的客觀指標(biāo)。雖然功能完整的線粒體是細(xì)胞內(nèi)各種生存信號的靶效應(yīng)器，但是對缺血再灌注損傷所引起的細(xì)胞死亡信號非常敏感[14]，當(dāng)心肌缺血再灌注時線粒體結(jié)構(gòu)及呼吸功能受損導(dǎo)致ATP合成減少，會進(jìn)一步加重心肌損傷[15]。因此，改善線粒體呼吸功能是減輕缺血心肌損傷的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Spost組HIF-1α表達(dá)上調(diào)，伴隨State3、RCR明顯改善且ATP、膜電位也不同程度增加。同時線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞少，比I/R組較好地維持了線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性。提示HIF-1α表達(dá)上調(diào)可改善線粒體功能減輕心肌缺血再灌注損傷。有研究表明，HIF-1α是心肌內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的關(guān)鍵靶標(biāo)，缺氧情況下HIF-1α表達(dá)增加不但可調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈能量生成及維持CcO的活性，還能夠減少線粒體來源的活性氧，從而避免心肌細(xì)胞損傷[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α表達(dá)增加可以激活VEGF表達(dá)促血管生成信號，進(jìn)一步減少心肌梗死面積[17,18]。雖然以上研究都表明HIF-1α表達(dá)的增加能夠減輕缺血心肌損傷，但并未闡明HIF-1α發(fā)揮心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制。本研究重點(diǎn)關(guān)注Spost對抗心肌缺血再灌注時HIF-1α對線粒體功的影響，發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)增加后改善線粒體呼吸功能或許是Spost發(fā)揮心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵。

為進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1α是介導(dǎo)Spost改善線粒體呼吸功能減輕心肌缺血再灌注損傷的重要靶標(biāo)，本研究使用了HIF-1α的抑制劑2ME2，發(fā)現(xiàn)HIF-1α被抑制后上述改善消失。這說明在心肌缺血再灌注損傷時，HIF-1α是通過介導(dǎo)Spost穩(wěn)定膜電位、改善線粒體呼吸、促進(jìn)ATP生成，減輕缺血心肌損傷。但Necká?等人卻認(rèn)為HIF-1α是通過降解酶脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白3（PHD3）來降低心肌梗死面積[19]。由此可見，HIF-1α表達(dá)增加可能通過多種途徑來對抗心肌缺血再灌注損傷，但具體分子機(jī)制還有待大量的研究去闡明。

綜上所述，HIF-1α表達(dá)上調(diào)后改善線粒體功能可能是七氟醚后處理發(fā)揮保護(hù)作用的內(nèi)在機(jī)制。但本研究只限于離體水平，下一步還需通過在體動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HIF-1α在七氟醚后處理中的作用，并為臨床麻醉中應(yīng)用七氟醚后處理發(fā)揮心肌保護(hù)作用提供理論依據(jù)。