蘭科植物組織培養(yǎng)研究進展

黃立華

摘要? ? 以蘭科植物為研究對象，從外植體、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、有機添加物和其他影響因素等方面簡要闡述了其組培研究進展，旨在為其組培研究提供參考。

關(guān)鍵詞? ? 蘭科植物;組織培養(yǎng);外植體;培養(yǎng)基;生長調(diào)節(jié)劑;有機添加物

中圖分類號? ? S682.31;S722.3+7? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）08-0131-01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

蘭科植物是園林植物中最廣泛的栽培植物之一，為被子植物中的一個大科，包括700個屬2.5萬個種[1-3]。其種子細小，大多需與共生菌協(xié)同作用，才可以保證其正常生長[4]。分株繁殖是其常見的方法，但缺點是繁殖系數(shù)較其他方式低而慢，每年僅能得到2～3倍的增殖[5]。因此，探索其他繁殖方式就顯得尤為重要[6]。

1960年，大花蕙蘭的莖尖首次被應(yīng)用于KC上進行培養(yǎng)誘導，產(chǎn)生了類原球莖，之后通過分化培養(yǎng)，成功誘導組培苗[7-9];1967年和1970年，分別以石斛蘭的頂芽和側(cè)芽分生組織作為研究材料，也成功誘導產(chǎn)生了類原球莖[10-11]。我國對蘭科植物的組培研究相對落后，1984年成功獲得霍山石斛的無菌植株，開始了蘭科植物組培的相關(guān)研究，之后在對兜唇石斛、束花石斛和鐵皮石斛等研究中，采用組培技術(shù)，成功獲得了這些材料的再生無菌植株[12]。到目前為止，蘭科植物組培技術(shù)的研究已經(jīng)逐步深入，已具備完善的組培條件，組培繁殖已成為蘭科植物繁殖的有效途徑[13-15]。

1? ? 外植體選擇

依據(jù)研究目的的不同和現(xiàn)有培養(yǎng)條件的差異，在外植體選擇方面有較大的差異性。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，莖尖、種子、原球莖（類原球莖）、試管苗、葉、莖、幼根、花序和花梗等器官都能作為蘭科植物的外植體[3]。生產(chǎn)上常用的幾種蘭花如卡特蘭、大花蕙蘭、石斛蘭和蝴蝶蘭等，都是選用莖尖為外植體，經(jīng)過多次試驗，獲得了再生植株[13-15]。國內(nèi)外學者通過對外植體不同的生長部位和不同的取材時期研究表明，植株中心部分的側(cè)芽，成活率達到較高水平，且在莖和芽的生長初期采集材料，成活率也表現(xiàn)出較高的水平[13-16]。利用莖段作為研究材料，結(jié)果表明，在適宜的培養(yǎng)條件下，莖段都能夠于莖節(jié)處誘導出芽[3]。

1997年，Nayak以2種蘭花的假鱗莖作為研究材料，通過對切段處進行芽誘導試驗表明，水平放置的假鱗莖切段能產(chǎn)生新芽，而垂直放置的未誘導出芽，這一現(xiàn)象可能與生長素的極性運輸關(guān)系密切[3-4]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，利用蘭花種子作為外植體在組培中的應(yīng)用前景非?？捎^[3]。一般完全正常發(fā)育的蘭花莢果，通常有104～105粒種子，但在自然狀態(tài)下，其種子很難萌發(fā)，需要與真菌之間形成共生關(guān)系才能萌發(fā)[3]。近年來，隨著科技的發(fā)展和國內(nèi)外研究者的深入研究發(fā)現(xiàn)，蘭花種子能夠非共生萌發(fā)，但需要在無菌條件下[3];同時研究還發(fā)現(xiàn)，一些尚未成熟或即將成熟的種子比完全成熟的種子更易萌發(fā)[17]。通過對組培試驗的深入研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)蘭花種子能夠利用這種方式獲得再生植株，雜交種子、附生蘭和氣生蘭最易萌發(fā)，而地生蘭種子較難萌發(fā)[18-19]。

研究發(fā)現(xiàn)，不同的取材部位和取材時期誘導效果顯著不同。一般種子和胚易于誘導形成植株，而葉片則比較困難，春季取材的外植體更易誘導成功，組培周期也較短[13-14]。

2? ? 培養(yǎng)基選擇

國內(nèi)外學者以蘭花為研究對象，對其培養(yǎng)基的研究發(fā)現(xiàn)，目前利用較多的為MS、KC、B5、VW和Knudson[13-15]。培養(yǎng)基的選擇是根據(jù)其所含的營養(yǎng)元素種類、培養(yǎng)的品種、培養(yǎng)階段和培養(yǎng)目標而定的[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)，春蘭適宜含無機鹽少的培養(yǎng)基，而蕙蘭相反，墨蘭對無機鹽卻不敏感[3]。Devi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，馬齒蘭莖尖產(chǎn)生擬原球莖的最佳培養(yǎng)基為Nitch;通過對Den. fimbriatum的蒴果研究時發(fā)現(xiàn)，其作為外植體進行胚萌發(fā)時，最佳培養(yǎng)基為Nitch和VW，這2種培養(yǎng)基種子的成活率較高，同時也能快速產(chǎn)生擬原球莖[3]。試驗表明，鐵皮石斛最適擬原球莖生長培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基;種子萌發(fā)和離體葉片最適培養(yǎng)基為MS和N6，莖段生長最適培養(yǎng)基為White和KC[21]。

3? ? 植物生長調(diào)節(jié)劑選擇

組織培養(yǎng)包括類生長素和細胞分裂素兩大類生長調(diào)節(jié)劑[22]。類生長素主要包括NAA、2，4-D、IAA[22];1991年，Kerb-auy[23]以卡特蘭根尖作為研究對象，對其進行組培時發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的產(chǎn)生是由2，4-D作用產(chǎn)生的。細胞分裂素主要包括 ZT、KT和6-BA[22]。研究者通過多年研究發(fā)現(xiàn)，既具有生長素功能又具有細胞分裂素功能的生長調(diào)節(jié)劑為TDZ[3]。TDZ的首次應(yīng)用，是Nihar以石斛蘭為材料，研究TDZ和6-BA對其組培的效果，結(jié)果表明，TDZ的作用效果較6-BA好，但 TDZ濃度要控制在一定的范圍，高濃度會抑制莖和芽的再生與增殖[24]。通過使用5種藥用石斛的莖段為材料進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)適合環(huán)草石斛、鐵皮石斛和金釵石斛腋芽誘導的6-BA/NAA比值為10～20，而束花石斛和馬鞭石斛適合的比值為 2～4[25]。周根余等[26]在附加6-BA（0.5 mg/L）和2，4-D（0.5～2.0 mg/L）的 MS培養(yǎng)基上，由葉片誘導得到愈傷組織并進一步分化得到離體再生植株，同時指出了2，4-D在促進愈傷組織形成及分化方面的積極作用，NAA在擬原球莖分化方面也有重要的作用，這與Kerbauy的研究結(jié)果一致?？傮w來說，高濃度的細胞分裂素有利于芽的誘導，低濃度則有利于愈傷組織和擬原球莖的誘導，高濃度的2，4-D也有相似的促進作用[22]。

4? ? 有機添加物選擇

蘭科植物組培過程當中利用較多的有機添加物包括水解酪蛋白、馬鈴薯汁、椰子汁和香蕉汁等[27-29]。這些物質(zhì)當中一般含有一定量激素、氨基酸和維生素[27-29]。研究發(fā)現(xiàn)，這類物質(zhì)對利用組培進行植株再生時，有顯著的促進作用[3]。曾宋君等[27]研究表明，在組培過程中添加這類物質(zhì)（椰子水、香蕉汁、馬鈴薯汁），能夠?qū)κ吭鲋澈驮蚯o的形成產(chǎn)生明顯的促進作用。張啟香等[28]將鐵皮石斛的莖尖作為研究材料誘導產(chǎn)生原球莖時發(fā)現(xiàn)，加入定量的土豆汁能夠明顯抑制褐化的產(chǎn)生，降低了不良影響的產(chǎn)生，同時大幅度提升了原球莖增殖系數(shù)。對鐵皮石斛叢生芽增殖的誘導研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入香蕉汁、西瓜汁和馬鈴薯汁有顯著的促進作用，同時研究還發(fā)現(xiàn)，香蕉汁可以促使叢生芽的增殖和生根[29]。

5? ? 其他影響因素

培養(yǎng)條件也是影響蘭科植物組培快繁的關(guān)鍵因子[3]，其主要包括pH值、光強、溫度、光照長短等外部因子[13-15]。一般蘭科植物組培適宜的pH值范圍在5.6～5.8之間，但不同的材料和不同的時期對pH值的要求有所不同[13-15]。以鐵皮石斛為研究材料對擬原球莖的最適培養(yǎng)條件研究發(fā)現(xiàn)，擬原球莖在pH值為5.0時長勢最佳;其次是在pH值5.4和 5.8的條件下;在pH值4.5和6.4的環(huán)境條件下生長最慢;當pH值為6.4時，擬原球莖出現(xiàn)黃化、死亡等不良狀況[26]。還有一個重要影響因子是滅菌時間[26]，曾宋君等[27]在對5種石斛蘭研究時發(fā)現(xiàn)，嫩枝莖尖的最佳滅菌時間應(yīng)<10 min，選用10% NaClO;蘭科植物組培常用的滅菌溫度為23～27 ℃，光照強度約36 μmol/（m2·s），光照時間為11 h/d左右。

6? ? 參考文獻

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