化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究

邱明山 陳進(jìn)春 林雙杰 錢麗霞 張少紅 李良成

【摘 要】目的：觀察化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的影響及其機(jī)制。方法：將20只新西蘭兔隨機(jī)分為化痰通絡(luò)方高（HTTL-h）、中（HTTL-m）、低（HTTL-l）劑量組，雷公藤多苷組（TG組），生理鹽水組（Sal組），每組4只。分離鑒定健康新生兒HUVEC，siRNA敲降VEGFR2、PLCG1以及MAPK1，并采用RT-PCR和及Western Blot檢測(cè)VEGFR2、PLCG1和MAPK1 mRNA 及蛋白水平的表達(dá)。MTT法檢測(cè)經(jīng)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖情況。結(jié)果：與Sal組比較，VEGF可顯著促進(jìn)HUVEC增殖，而TG或HTTL-l均可顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖;siRNA敲降VEGFR2后，VEGF則不能促進(jìn)HUVEC增殖，同時(shí)TG也失去了對(duì)HUVEC增殖的抑制能力;siRNA敲降PLCG1后，VEGF依然可以顯著促進(jìn)HUVEC增殖，此時(shí)TG對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖失去了抑制效應(yīng)，但HTTL-m和HTTL-l依然對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖具有顯著抑制效應(yīng);siRNA敲降MAPK1后，VEGF也可顯著促進(jìn)HUVEC增殖，TG對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖具有抑制效應(yīng)，同時(shí)HTTL-l也對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖具有顯著抑制效應(yīng)。結(jié)論：化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖具有抑制作用。TG抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖依賴于VEGFR2和PLCG1表達(dá)，而化痰通絡(luò)方對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖的抑制效應(yīng)則不依賴VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信號(hào)通路。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;化痰通絡(luò)方;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;增殖;信號(hào)傳導(dǎo)通路

【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of serum containing Huatan Tongluo Fang（HTTL，化痰通絡(luò)方）on the proliferation of HUVEC induced by VEGF and its mechanism.Methods：Twenty New Zealand rabbits were randomly divided into the High（HTTL-h），medium（HTTL-m），low（HTTL-l） dose groups，the Tripterygium wilfordii glycoside group（TG group） and the saline containing serum group（Sal group），4 rabbits in each group.Healthy neonates HUVEC were isolated and identified，and siRNA knocked down VEGFR2，PLCG1，and MAPK1.RT-PCR as well as Western Blot were used to detect the expressions of VEGFR2，PLCG1，MAPK1 mRNA and protein levels.The proliferation of HUVEC induced by VEGF was detected by MTT.Results：Compared with the Sal group，VEGF could significantly promote HUVEC prolifer-ation，while TG or HTTL-l could significantly inhibit HUVEC proliferation induced by?VEGF.After siRNA knocked down VEGFR2，VEGF could not promote HUVEC proliferation，while TG also lost the inhibition of HUVEC proliferation.After siRNA knocked down PLCG1，VEGF could still significantly promote HUVEC proliferation，and at this time TG could not stimulate HUVEC proliferation stimulated by VEGF.However，HTTL-m and HTTL-l still had a significant inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF.After siRNA knocked down MAPK1，VEGF could also significantly promote HUVEC proliferation，TG had a inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF，and HTTL-l also had a significant inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF.Conclusion：The serum containing HTTL can inhibit the proliferation of HUVEC induced by VEGF.In TG group，the inhibition of HUVEC proliferation induced by VEGF depended on the expression of VEGFR2 and PLCG1，while the inhibition of HTTL on HUVEC proliferation stimulated by VEGF did not depend on the VEGF/VEGFR2/ PLCG1/ MAPK1 signal pathway.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;Huatan Tongluo Fang（化痰通絡(luò)方）;VEGF;HUVEC;proliferation;

signal transduction pathway

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以血管異常增生、關(guān)節(jié)滑膜炎為基本病理表現(xiàn)的自身免疫反應(yīng)性疾病[1-2]。血管異常增生是RA滑膜炎和血管翳的基礎(chǔ)[2]，促進(jìn)血管形成的最主要因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）。VEGF可通過作用于關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)以及基底組織的微血管或毛細(xì)血管促進(jìn)其增生[3]。筆者根據(jù)歷代醫(yī)家對(duì)痰、瘀致痹的認(rèn)識(shí)，結(jié)合臨床觀察、治療實(shí)踐以及前期的實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)出痰濁、瘀血的病理變化貫穿于RA的發(fā)病過程，并以化痰通絡(luò)方治療RA，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中取得了較好的療效[4-5]。在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)化痰通絡(luò)方能抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF和VEGFR2表達(dá)，進(jìn)而抑制血管增生和血管翳的形成[6]。本研究中，筆者利用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），通過敲降VEGFR2/PLACG1/MAPK1觀察化痰通絡(luò)方抑制血管增生的潛在機(jī)制，以期能進(jìn)一步了解化痰通絡(luò)方發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 雄性新西蘭兔20只，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0011，由廈門大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得廈門大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。細(xì)胞株：獲得健康志愿者簽署知情同意書，通過健康新生兒臍帶分離培養(yǎng)HUVEC。健康新生兒臍帶，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)B門市中醫(yī)院產(chǎn)科提供。

1.2 藥品與試劑 化痰通絡(luò)方（膽南星10 g、桃仁10 g、僵蠶10 g、白芥子10 g、白芍15 g，以上中藥飲片均由康美藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，為同一批號(hào)產(chǎn)品）。雷公藤多苷片（TG，福建匯天生物藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z35020431，規(guī)格10 mg/片）;

cDNA合成逆轉(zhuǎn)試劑盒（Thermo Fisher Scientific，K1622）;TransStart Top Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，K10225）;DAB染色（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）;siRNA利用Thermofisher提供的在線設(shè)計(jì)工具進(jìn)行設(shè)計(jì)，并在上海吉馬生物技術(shù)公司合成。

1.3 儀 器 PCR儀（Bio-Rad，S1000）;倒置顯微鏡（Olympus，BX53F）;顯微照相系統(tǒng)（Olympus，U-TV05XC-3）;電熱恒溫水浴箱（上海精宏，DK-8D）;超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）;自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Rad，iMark）;流式細(xì)胞儀（EPICS ALTRA）;-80℃低溫冰箱（Thermo Scientific，8920）。

2 方 法

2.1 化痰通絡(luò)方含藥血清的制備 將20只新西蘭兔隨機(jī)分為化痰通絡(luò)方高（HTTL-h）、中（HTTL-m）、低（HTTL-l）劑量組，TG組和生理鹽水組（Sal組），每組4只。分別灌胃化痰通絡(luò)方、TG、Sal，每日早、晚各灌胃1次。實(shí)際灌胃劑量按動(dòng)物體表面積換算得出，每公斤體質(zhì)量每日灌胃量為1，5，10倍臨床等效劑量，HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l組按4.5 g·kg-1·d-1、22.5 g·kg-1·d-1、45 g·kg-1·d-1灌胃化痰通絡(luò)方，TG組按7.35 g·kg-1·d-1灌胃TG，連續(xù)灌胃3 d，禁食12 h后灌胃1次（1 d的量），共灌7次，1 h后乙醚麻醉動(dòng)物，無菌條件下心臟采血。將抽取的血液室溫下靜置3 h，離心，取上清，56 ℃水浴中滅活30 min，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HUVEC的培養(yǎng) HUVEC分離培養(yǎng)采用阮溦等[7]改良的方法。取健康新生兒臍帶，以Ⅱ型膠原酶消化，離心分離后加入完全培養(yǎng)基（M199、體積分?jǐn)?shù)為10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.67%的HEPES、8 ng·mL-1 VEGF）培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)的HUVEC進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞檢測(cè)，選取CD106陰性、CD31陽性率 > 99%的HUVEC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT法檢測(cè)化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖

2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將HUVEC分為以下7組：HUVEC組，HUVEC + VEGF組，HUVEC + VEGF +?Sal組，HUVEC + VEGF + TG組，HUVEC + VEGF + HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l劑量組。

2.3.2 各組細(xì)胞處理 在實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)不同濃度的VEGF、血清探討，最終選擇12.5 ng·mL-1的VEGF與體積分?jǐn)?shù)為5%的血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取上述培養(yǎng)的HUVEC，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的胰酶消化后接種于96孔培養(yǎng)板，5000細(xì)胞/孔，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的Sal血清，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的TG含藥血清及HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l組質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的化痰通絡(luò)方含藥血清，每組均設(shè)復(fù)孔3個(gè)，培養(yǎng)4 h。加入12.5 ng·mL-1 VEGF 再分別培養(yǎng)12，24，48 h。

2.3.3 MTT法檢測(cè)HUVEC增殖 棄原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)液，30 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），37 ℃培養(yǎng)4 h。200 μL DMSO溶解，振蕩混勻。在自動(dòng)酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度值。細(xì)胞增殖率 = （實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

2.4 siRNA下調(diào)VEGFR2、PLCG1和MAPK1的表達(dá) 分別設(shè)計(jì)、優(yōu)化了敲降VEGFR2、PLCG1以及MAPK1的siRNA 序列（見表1）。用羅氏X-treme GENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑將上述siRNA序列分別轉(zhuǎn)染HUVEC，72 h后，胰酶消化，收細(xì)胞-80 ℃凍存，分別進(jìn)行RT-PCR和Western Blot檢測(cè)敲降效率。

2.5 RT-PCR檢測(cè)siRNA 敲 降效率 取上述凍存細(xì)胞，加入1 mL Trizol按照常規(guī)方法提取總RNA。依據(jù)MBI Fermentas的逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后利用表2引物分別按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)均為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，31個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。GAPDH為內(nèi)參。見表2。

2.6 Western Blot檢測(cè)siRNA敲降效率 提取各組細(xì)胞總蛋白，用考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒測(cè)定各組樣本蛋白質(zhì)濃度，樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、加入一抗（VEGFR2、PLCG1和MAPK1）和二抗（IgG）、顯影、成像。

2.7 MTT檢測(cè)化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)經(jīng)RNA干擾VEGFR2、PLCG1和MAPK1的HUVEC增殖 方法同2.3.3。

2.8 觀察化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC血管環(huán)形成的影響 將Matrigel基質(zhì)膠放置4 ℃冰箱中過夜融化，在預(yù)冷的48孔板中加入60 μL稀釋的Matrigel基質(zhì)膠溶液，37 ℃放置40 min使溶液凝固。然后每孔加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的HUVEC（1.5×104/孔）凝膠表面，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。分別加入體積分?jǐn)?shù)為5%的Sal血清，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的TG含藥血清及HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l劑量組質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的含藥血清，每組均設(shè)復(fù)孔3個(gè)，培養(yǎng)4 h。加入12.5 ng·mL-1 VEGF再分別培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察血管環(huán)形成，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照，計(jì)數(shù)血管環(huán)，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 HUVEC鑒定及對(duì)VEGF敏感性測(cè)定 HUVEC進(jìn)行CD106（間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志）及CD31（血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物）鑒定，結(jié)果如圖1所示，筆者所分離到的細(xì)胞CD31陽性（陽性率99%以上）而無間充質(zhì)干細(xì)胞污染（CD106陰性）;同時(shí)，分離的HUVEC對(duì)VEGF的應(yīng)答能力在12.5 ng·mL-1，

25 ng·mL-1時(shí)均可顯著促進(jìn)HUVEC增殖，見表3;因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)筆者選擇12.5 ng·mL-1為VEGF的劑量刺激HUVEC;為了觀測(cè)含藥血清對(duì)HUVEC增殖的影響，筆者也探討了2.5%、5%及10%體積分?jǐn)?shù)的正常兔血清對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖，在培養(yǎng)的12，24，48 h內(nèi)均無顯著影響，見表4。所以選擇兔血清體積分?jǐn)?shù)為5%的含藥血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

其后筆者檢測(cè)了siRNA分別下調(diào)HUVEC中VEGFR2、PLCG1和MAPK1后，化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)HUVEC增殖的影響。結(jié)果顯示，SCR組VEGF可顯著促進(jìn)HUVEC增殖（P < 0.05），而TG或HTTL-l含藥血清均可顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖（P < 0.01）;siRNA敲降VEGFR2后，VEGF則不能促進(jìn)HUVEC的增殖（P > 0.05），同時(shí)TG含藥血清也失去了對(duì)HUVEC增殖的抑制能力。提示VEGF刺激的HUVEC增殖依賴于VEGFR2的表達(dá)，而TG發(fā)揮作用也依賴于VEGF-VEGFR2信號(hào)通路;siRNA敲降PLCG1后VEGF依然可以顯著促進(jìn)HUVEC增殖（P < 0.01）。提示VEGF/VEGFR2激活后存在不依賴于PLCG1而促進(jìn)HUVEC增殖的信號(hào)通路;此時(shí)，TG對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖失去了抑制效應(yīng)。但HTTL-m、HTTL-l含藥血清依然對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖具有顯著抑制效應(yīng)（P < 0.05）。siRNA敲降MAPK1后VEGF也可顯著促進(jìn)HUVEC增殖（P < 0.05），TG對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖具有抑制效應(yīng)（P < 0.01），同時(shí)HTTL-l含藥血清也對(duì)VEGF刺激的HUVEC增殖具有顯著抑制效應(yīng)（P < 0.01）。提示存在不依賴于PLCG1以及MAPK1的VEGF/VEGFR2促進(jìn)HUVEC增殖的信號(hào)通路;TG抑制VEGF刺激的HUVEC增殖依賴于VEGFR2以及PLCG1的表達(dá);而化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)VEGF刺激的HUVEC的增殖不依賴于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信號(hào)通路。見圖4。

3.4 化痰通絡(luò)方含藥血清可顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC血管環(huán)形成 為了進(jìn)一步闡明化痰通絡(luò)方對(duì)血管形成的影響，筆者觀察了HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l含藥血清對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC血管環(huán)形成的影響。結(jié)果顯示，與Sal組比較，TG含藥血清可顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的血管環(huán)形成;HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l含藥血清也可顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的血管環(huán)形成，且呈劑量依賴性。見圖5、圖6。

4 討 論

4.1 血管增生在RA 發(fā)病中的作用 RA主要病理變化為關(guān)節(jié)滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成。血管異常增生是RA慢性增生性滑膜炎和血管翳的基礎(chǔ)[1-2]。血管的生成受血管生成刺激因子及抑制因子的雙重調(diào)節(jié)，即血管生成平衡假說，當(dāng)血管生成刺激因子異常增高時(shí)，這種平衡被打破，出現(xiàn)病理性血管增生。RA血管病理性增生中最重要的促進(jìn)血管形成的因子是VEGF[3]。中和VEGF可抑制膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[8]，表明VEGF所誘導(dǎo)的血管增生在RA發(fā)病中具有非常重要的作用。

4.2 化痰通絡(luò)方的組方原則及現(xiàn)代藥理研究 痰、瘀作為各證型共性的病理變化貫穿于RA整個(gè)發(fā)病過程，痰濁瘀血既是機(jī)體在致病因素作用下的病理產(chǎn)物，又可作為致病因素作用于機(jī)體。因此，筆者提出了RA以疏暢氣機(jī)、化痰活血為主要治法的化痰通絡(luò)法，應(yīng)貫穿于治療的始終?；谏鲜鲇^點(diǎn)，筆者選取膽南星、桃仁、白芥子、僵蠶、山慈菇作為化痰通絡(luò)方的藥物組成。南星“治痰功同半夏”，但半夏雖屬辛散，專理脾胃濕痰，而南星辛散之力勝過半夏，專主經(jīng)絡(luò)風(fēng)痰;膽南星為南星經(jīng)過牛膽汁炮制，燥性已減，性味苦涼，兼清痰熱，對(duì)于痰瘀郁熱更為妥當(dāng)。桃仁味苦，入心肝血分，活血散瘀之力強(qiáng)，有推陳致新之功[9]。兩者同用，有化痰祛風(fēng)、消腫散結(jié)、活血化瘀、通絡(luò)止痛之功，共為君藥。白芥子溫通經(jīng)脈、消腫散結(jié)加強(qiáng)膽南星化痰通絡(luò)之力，而為臣藥。僵蠶化痰散結(jié)、滌化痰濁、祛風(fēng)止痛，助膽南星化痰祛風(fēng)通絡(luò)之力，白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，兩藥均為佐使藥。全方共奏化痰活血、通絡(luò)蠲痹之功。

本項(xiàng)研究中，筆者應(yīng)用MTT、Western Blot、RT-PCR、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等技術(shù)，以TG為陽性藥，觀察了化痰通絡(luò)方含藥血清對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖的影響。結(jié)果顯示，TG和化痰通絡(luò)方均能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖和血管環(huán)形成，同時(shí)應(yīng)用siRNA分別下調(diào)HUVEC中VEGFR2、PLCG1后，TG不能阻斷VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的增殖和血管環(huán)形成;而siRNA下調(diào)HUVEC中VEGFR2、PLCG1和MAPK1后，化痰通絡(luò)方含藥血清可完全阻斷VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的增殖。提示TG抑制VEGF刺激的HUVEC增殖依賴于VEGFR2以及PLCG1的表達(dá)，而化痰通絡(luò)方抑制VEGF刺激的HUVEC的增殖不依賴于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信號(hào)通路。

綜上所述，筆者認(rèn)為，化痰通絡(luò)方能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖和血管環(huán)形成，但其作用機(jī)制不依賴于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信號(hào)通路。

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收稿日期：2019-08-27;修回日期：2019-10-25