諸氏鯔蝦虎魚出血病病原鑒定及傳播途徑分析

余露軍，李建軍，蔡磊，黃韌

(廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所，廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)屬于鱸形目(Perciformes)、蝦虎魚亞目(Gobioidei)、蝦虎魚科(Gobiidae)、鯔蝦虎魚屬(Mugilogobius)，在我國南海、東海等西太平洋近海海域廣泛分布，是我國實(shí)驗(yàn)動物化水平最高的本土海洋實(shí)驗(yàn)魚類，具有體形小、胚胎透明、繁殖量大、繁殖周期短等特點(diǎn)[1]。蝦虎魚已在海洋環(huán)境重金屬[2]、多環(huán)芳烴[3]等多種污染物的毒性評價和疾病模型研究[4]中廣泛應(yīng)用，顯示出良好的應(yīng)用前景。

廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所先后開展蝦虎魚全人工繁殖、封閉群和近交系培育，以及種質(zhì)、遺傳、微生物和寄生蟲、飼料及環(huán)境設(shè)施等質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系研究[1]，其中病原項目是蝦虎魚質(zhì)量控制的重要內(nèi)容。目前，已有遲緩愛德華菌[5]、創(chuàng)傷弧菌[6]感染引起蝦虎魚“潰爛病”和“敗血癥”的研究報道，而對蝦虎魚“出血病”的病原研究尚未見報道。石斑魚、對蝦等多種水生經(jīng)濟(jì)動物研究表明，外來動物個體、生物餌料、水源是水生動物病原傳播的主要途徑[7-8]。相對經(jīng)濟(jì)魚類而言，實(shí)驗(yàn)魚的養(yǎng)殖條件相對封閉和可控，病原傳播途徑和風(fēng)險也可能有所不同，但相關(guān)研究鮮有報道。本文對野外采樣的患出血病蝦虎魚進(jìn)行病原分析，并對不同來源的海水、生物餌料、魚體等樣品進(jìn)行了病原檢測，探討實(shí)驗(yàn)魚病原傳播途徑，為蝦虎魚微生物質(zhì)量控制及病原防控策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)魚

患病諸氏鯔蝦虎魚體長2.5 ～ 3.5 cm，取自深圳大鵬灣野生群?；貧w感染實(shí)驗(yàn)用諸氏鯔蝦虎魚為本實(shí)驗(yàn)室封閉群子14代，4 ～ 5月齡，體長2.5 ～ 3.0 cm，循環(huán)水養(yǎng)殖，鹽度20 ～ 22，溫度25 ～ 27℃，光照：黑暗時間為14 h:10 h。

1.1.2 試劑與儀器

腦心浸液培養(yǎng)基(Brian Heart Infusion Medium, BHI)(廣州環(huán)凱公司，中國)；細(xì)菌基因組試劑盒(天根公司，中國)；Taq酶(TaKaRa，日本)。

生物顯微鏡(Nikon Ci-S，日本)；電子天平(常熟雙杰測試儀器廠，中國)；ATB全自動細(xì)菌鑒定儀(梅里埃公司，法國)；PCR擴(kuò)增儀(Techne Prime，英國)；凝膠電泳儀和成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、純化

挑選腹部紅腫的個體，無菌操作解剖病魚，并從肝臟部位取樣劃線接種于BHI平板，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取優(yōu)勢菌落在同樣條件下進(jìn)行純化培養(yǎng)，用于細(xì)菌鑒定。

1.2.2 細(xì)菌鑒定

(1)生化鑒定：觀察分離純化的菌落形態(tài)，并通過革蘭氏染色、氧化酶試驗(yàn)以及API ID32E試劑條進(jìn)行鑒定。

(2)分子生物學(xué)鑒定：按細(xì)菌基因組試劑盒說明書提取新鮮培養(yǎng)菌液的DNA，按Zhang等[9]的方法對嗜水氣單胞菌gryB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參照饒靜靜等[10]的方法對嗜水氣單胞菌溶血素基因(hlyA)和氣溶素基因(earA)進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增(引物濃度1∶3)，引物序列見表1。gryB基因PCR反應(yīng)條件為：95℃ 4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。aerA和hlyA基因雙重PCR反應(yīng)條件為：95℃ 4 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。gryB基因PCR產(chǎn)物純化后送上海生工進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行Blast分析，選取相似序列MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 回歸感染

挑取優(yōu)勢菌純化后的單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，新鮮培養(yǎng)的菌液6000 r/min離心3 min后，棄上清，無菌生理鹽水重懸，用ATB比濁儀將菌液等比稀釋至1.8 × 108～ 1.8 × 104cfu/mL。選取健康諸氏鯔蝦虎魚封閉群個體，每組10尾，腹腔注射，每尾注射0.02 mL菌液，同時設(shè)置生理鹽水對照組。人工感染期間不投喂，靜水養(yǎng)殖，水溫25 ～ 26℃，鹽度20 ～ 22，每天記錄死亡數(shù)量并及時撈出死魚，連續(xù)觀察10 d。按周一平[11]的方法計算半致死量(median lethal dose, LD50)。從感染后癥狀明顯的個體肝臟組織再次進(jìn)行細(xì)菌分離和回歸感染。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Sequences of the primers used in the experiment

1.2.4 病原傳播途徑分析

(1)樣品采集

2016年3月 ～ 6月，先后從深圳大鵬灣、番禺南沙以及惠州大亞灣采集野生蝦虎魚(共3批次)，3、5、8月分別取本實(shí)驗(yàn)室培育的蝦虎魚封閉群(4 ～ 5月齡，體長2.5 ～ 3.0 cm，共3批次)；從海南瓊海、福建漳州、惠州大亞灣購買野生輪蟲(各2批次)，3、5、8月分別取本室內(nèi)培育輪蟲(共3批次)；從廣州芳村花鳥魚蟲市場購買市售6個商品化的鹵蟲卵；3、5、8月分別取購買的天然海水和封閉群養(yǎng)殖水樣品(各3批次)。各批次樣品取樣方法如下：

魚：隨機(jī)取3尾蝦虎魚的肝、脾組織混合為一個樣品；鹵蟲：鹵蟲卵在實(shí)驗(yàn)條件下[漂白水消毒處理的潔凈海水鹽度28 ± 2，水溫(28 ± 1)℃，光照2000 Lux]孵化24 h后，新孵出的鹵蟲無節(jié)幼體經(jīng)潔凈海水清洗3次，取0.1 mg(鮮重)鹵蟲無節(jié)幼體作為一個樣品；輪蟲：輪蟲用300目紗絹網(wǎng)收集，并用潔凈海水清洗3次，取0.1 mg(鮮重)輪蟲作為為一個樣品；水：隨機(jī)取新購天然海水和蝦虎魚封閉群養(yǎng)殖水各10 mL為一個樣品。

(2)樣品處理

無菌條件下，將魚的肝脾組織、鹵蟲、輪蟲勻漿后，按體積比1∶9加入滅菌堿性蛋白胨水；水樣8000 r/min離心3 min后，棄上清，用10 mL滅菌堿性蛋白胨水重懸；28℃、150 r/min增菌培養(yǎng)12 h后，取2 mL增菌液12000 r/min離心收集細(xì)菌，采用細(xì)菌基因組試劑盒提取總DNA。

(3)樣品檢測

按1.2.2(2)的方法對嗜水氣單胞菌毒力基因hlyA和earA進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，檢測致病性嗜水氣單胞菌。

2 結(jié)果

2.1 諸氏鯔蝦虎魚出血病癥狀

患病蝦虎魚身體發(fā)黑，聚群沉底，活力下降，反應(yīng)遲鈍；腹部(尤其是肛門處)紅腫充血；下頜及胸鰭、腹鰭基部出血，鰭條缺損；剖檢可見腹腔有積水，腸系膜有出血點(diǎn)，并附著淡紅色粘液。

2.2 分離株形態(tài)與生化特性

從臨床癥狀典型個體的肝臟部位分離獲得優(yōu)勢菌(編號PYMc15-1)，BHI平板28℃培養(yǎng)24 h后，PYMc15-1菌落呈圓形凸起、淡黃色、半透明、表面光滑、直徑約1.0 ～ 1.5 mm，有特殊氣味。革蘭氏染色顯示為陰性、桿菌，氧化酶反應(yīng)為陽性。ATB全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定為嗜水氣單胞菌，鑒定結(jié)果ID：99.9%，T值：0.72，詳細(xì)生化結(jié)果見表2?；貧w感染后二次分離的優(yōu)勢菌PYMc15-1’生化特性與PYMc15-1一致。

2.3 gryB基因序列分析

菌株P(guān)YMc15-1經(jīng)嗜水氣單胞菌gryB基因引物PCR擴(kuò)增獲得800 bp左右目的片段，hlyA和aerA基因雙重PCR擴(kuò)增獲得800 bp和1300 bp左右目的片段(圖1)。gryB產(chǎn)物序列Blast分析結(jié)果顯示，菌株P(guān)YMc15-1與GenBank上登陸的嗜水氣單胞菌(登錄號 KX822741)同源性最高(98.5%)。菌株P(guān)YMc15-1gryB序列聚類分析顯示，PYMc15-1與嗜水氣單胞菌自然聚類(圖2)。上述結(jié)果表明，菌株P(guān)YMc15-1為嗜水氣單胞菌，并具有潛在的致病性。

2.4 人工感染

人工感染健康蝦虎魚后第2天開始出現(xiàn)死亡，第3天、第4天為高峰，死亡個體腹部和肛門紅腫充血，腹腔有大量積水。從第4天死亡個體肝臟部位分離細(xì)菌，獲得優(yōu)勢菌PYMc15-1，再次回歸感染健康蝦虎魚，出現(xiàn)相似癥狀，表明本次試驗(yàn)分離的優(yōu)勢菌PYMc15-1為蝦虎魚出血病病原。

表2 菌株P(guān)YMc15-1生化鑒定結(jié)果Table 2 Results of biochemical identification of strain PYMc15-1

注：“+”陽性；“-”陰性。

Note. “+” is positive; “-” is negative.

注：M為DL2000 bp Marker; 1為gryB基因PCR產(chǎn)物；2為aerA基因和hlyA基因雙重PCR產(chǎn)物。圖1 菌株P(guān)YMc15-1 gryB基因、aerA基因和hlyA基因PCR檢測電泳圖Note. M, DNA Marker DL 2000. 1, PCR product of gryB gene. 2, PCR products of aerA gene and hlyA gene.Figure 1 Electropherogram of strain PYMc15-1 gryB gene, aerA gene and hlyA gene of detected by PCR

不同濃度的PYMc15-1菌液人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，2.1×108cfu/mL濃度組實(shí)驗(yàn)魚全部死亡，生理鹽水對照組實(shí)驗(yàn)魚無死亡，菌株P(guān)YMc15-1對蝦虎魚的LD50為每尾1.2×104cfu(表3)。

2.5 蝦虎魚、生物餌料及水的致病性嗜水氣單胞菌檢測

PCR檢測結(jié)果顯示，野生蝦虎魚(1/3)、鹵蟲無節(jié)幼體(1/6)和野生輪蟲(2/6)分別檢出致病性嗜水氣單胞菌，室內(nèi)培育的輪蟲以及天然海水、蝦虎魚封閉群養(yǎng)殖水均未檢出致病性嗜水氣單胞菌。

3 討論

本研究從患病蝦虎魚肝臟分離到優(yōu)勢菌株P(guān)YMc15-1，經(jīng)生物學(xué)特性、生化鑒定和gryB基因序列同源性分析，鑒定為嗜水氣單胞菌，并通過回歸感染確定為蝦虎魚出血病病原，對蝦虎魚具有較強(qiáng)的致病性(LD50為每尾1.2×104cfu)，為我國海水實(shí)驗(yàn)魚——蝦虎魚感染嗜水氣單胞菌的首次報道。嗜水氣單胞菌屬弧菌科、氣單胞菌屬，廣泛存在于水體、淤泥等環(huán)境中，具有廣泛的致病性，可引起多種海、淡水水生動物爆發(fā)性出血病，常造成水產(chǎn)養(yǎng)殖重大的經(jīng)濟(jì)損失[12-13]。嗜水氣單胞菌也是我國農(nóng)業(yè)部《一、二、三類動物疫病病種名錄》(2008年)規(guī)定的二類疫病病原，需要采取嚴(yán)格控制、撲滅等措施，防止擴(kuò)散的病原[14]。同時，我國淡水實(shí)驗(yàn)魚斑馬魚和劍尾魚已有嗜水氣單胞菌感染導(dǎo)致細(xì)菌性敗血癥的報道[15-16]；國內(nèi)19家斑馬魚實(shí)驗(yàn)室調(diào)研結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斑馬魚豎鱗、腹水是常見病害癥狀，雖然其病原尚未研究證實(shí)，但由于該癥狀與嗜水氣單胞菌感染魚類引起的臨床癥狀類似[17-18]，因此斑馬魚“豎鱗病”、“腹水病”很可能與嗜水氣單胞菌感染有關(guān)。上述結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌對蝦虎魚、斑馬魚等海、淡水實(shí)驗(yàn)魚均具有嚴(yán)重危害，在實(shí)驗(yàn)魚生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)引起足夠的重視并加以控制。

注： 節(jié)點(diǎn)處數(shù)值為自展重復(fù)1000次的置信值。圖2 基于氣單胞菌屬gryB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Note. The degree of confidence for each branch point was determined by bootstrap analysis (1000 repetitions).Figure 2 Phylogenetic tree based on gryB gene sequences of Aeromonas

表3 菌株P(guān)YMc15-1對蝦虎魚攻毒試驗(yàn)結(jié)果
Table 3 Results of of challenge test with strain PYMc15-1 inM.chulae

菌液濃度(cfu/mL)Bacterial concentration(cfu/mL)試驗(yàn)魚數(shù)(尾)Number of test fish死亡數(shù)(尾)Number of deaths半致死濃度(cfu/fish)LD50(cfu/fish)2.1 × 10810102.1 × 1071072.1 × 1061052.1 × 1051042.1 × 104103生理鹽水Physiological saline1001.2 × 104

gyrB是普遍存在于細(xì)菌中編碼DNA促旋酶亞基B蛋白的單拷貝基因，每100萬年的平均堿基替換率為0.7% ～ 0.8%，其進(jìn)化速率較16S rRNA快，且不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，特別適用于氣單胞菌、芽孢桿菌等近緣種的區(qū)別和鑒定[19-20]。氣單胞菌屬中常見的魚類病原菌多達(dá)20余種，其中多個菌種親緣關(guān)系接近，通過16S rRNA基因序列分析無法有效區(qū)分[21]。本研究對生化鑒定為嗜水氣單胞菌的分離株P(guān)YMc15-1進(jìn)行g(shù)yrB基因測序分析，其序列與已知的嗜水氣單胞菌(登錄號 KX822741)同源性達(dá)98.5%，與同屬不同種的溫和氣單胞菌(HQ442698)同源性則低于91.7%，顯示出較高的分辨率，可判定分離株P(guān)YMc15-1為嗜水氣單胞菌。值得注意的是，嗜水氣單胞菌有致病性菌株和非致病性菌株之分，朱大玲等[22]、王遠(yuǎn)微等[23]研究發(fā)現(xiàn)，只有致病性嗜水氣單胞菌aerA基因呈陽性擴(kuò)增；饒靜靜等[10]在致病性嗜水氣單胞菌中至少擴(kuò)增到aerA或hlyA基因的一種，可見aerA基因和hlyA基因是致病性嗜水氣單胞菌最為關(guān)鍵的毒力基因。本實(shí)驗(yàn)對分離株P(guān)YMc15-1aerA基因和hlyA基因進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示為陽性；回歸感染試驗(yàn)也表明該菌株對蝦虎魚具有致病性，表明分離株P(guān)YMc15-1為致病性嗜水氣單胞菌。

PCR檢測方法已成為國外大型實(shí)驗(yàn)動物機(jī)構(gòu)在實(shí)施實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量監(jiān)測和病原體診斷中的重要手段，在我國嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物病原檢測中已有較多應(yīng)用[24-25]。病原的傳播主要有水平傳播和垂直傳播兩種途徑，大多數(shù)水生動物病原的傳播以水平傳播為主[26]。本研究采用嗜水氣單胞菌hlyA基因和aerA基因特異性引物對蝦虎魚養(yǎng)殖過程相關(guān)的魚、生物餌料、水等樣品進(jìn)行致病性嗜水氣單胞菌檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生蝦虎魚、鹵蟲和野生輪蟲部分樣品檢出陽性，表明野生魚體、鹵蟲和野生輪蟲是嗜水氣單胞菌潛在的傳播媒介，這與Yan等[27]、Zhang等[28]、宋曉玲等[29]研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)中蝦虎魚封閉群及其養(yǎng)殖水、室內(nèi)凈化培育的輪蟲均未檢出致病性嗜水氣單胞菌，說明通過魚體隔離凈化、水體消毒以及輪蟲凈化培育能有效控制病原的傳播。不同來源、不同批次的6個鹵蟲樣品檢測中，有1個樣品檢出致病性嗜水氣單胞菌，表明通過病原檢測篩選合格的鹵蟲是必要的。鑒于生物餌料可能攜帶病原的情況，建議使用生物餌料時應(yīng)采用凈化培育、消毒等處理措施，并對各批次生物進(jìn)行病原檢測，以控制其病原微生物質(zhì)量。