糖尿病下肢潰瘍小鼠模型的建立與評價

魯珽，辛永萍，林家彬，陳民利

(1. 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院臨床研究中心，杭州 310009；2. 浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病之后，嚴重威脅人類健康的主要疾病之一。因糖尿病引起的外周血管病變(peripheral arterial disease，PAD)是正常人的2 ～ 4倍，可累及全身重要血管，導致多種血管并發(fā)癥，廣泛影響著世界范圍內(nèi)的糖尿病患者[1]。其中，糖尿病下肢血管病變在糖尿病患者中約占20%，常發(fā)展為嚴重下肢缺血，最終傷口難愈合、壞疽，甚至導致截肢[2]。目前，臨床上對于糖尿病下肢血管病變?nèi)悦媾R巨大困難，迄今也未發(fā)現(xiàn)特別有效的藥物和治療措施[3]，當病人足部發(fā)生壞疽時，截肢往往是患者和醫(yī)生的唯一辦法。模擬糖尿病并發(fā)外周血管疾病的動物模型，對糖尿病血管疾病研究至關(guān)重要。良好的動物模型可以幫助我們探究疾病的發(fā)病機制，篩選有效的治療藥物和措施。本實驗在糖尿病小鼠模型的基礎上建立下肢潰瘍模型，用激光多普勒監(jiān)測血流變化，觀察模型足部壞死情況和缺血組織病理改變。并與單純下肢缺血模型相比較，發(fā)現(xiàn)糖尿病下肢潰瘍模型的特殊性。為研究糖尿病外周血管病變的發(fā)病機制和治療措施提供依據(jù)和基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，8周齡，體重(35 ± 2)g，90只，來源于上海斯萊克實驗動物有限責任公司【SCXK(滬) 2017-0005】。飼養(yǎng)于浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院實驗動物中心屏障環(huán)境【SYXK(浙) 2015-0010】，飼喂60Co輻照全價營養(yǎng)顆粒飼料，溫度(22 ± 2)℃，相對濕度50% ～ 70%，12 h/12 h明暗交替，實驗動物倫理批件號：浙醫(yī)二院(2019年度)第(085)號。

1.1.2 試劑及儀器

鏈脲霉素(STZ，上海生工生物工程股份有限公司)；Anti-CD31抗體(ab28364，abcam)；Anti-alpha smooth muscle Actin抗體(ab124964，abcam)；Periscan PIM II激光多普勒血流成像儀掃描(瑞典帕瑞醫(yī)學科技有限公司)；濱松NanoZoomer數(shù)字病理切片掃描儀(日本濱松)；羅氏卓越型血糖測試儀(德國羅氏)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

所有ICR小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分成3組，每組30只，即糖尿病下肢潰瘍組、下肢缺血組和糖尿病組。糖尿病下肢潰瘍組和糖尿病組小鼠建立糖尿病模型；糖尿病下肢潰瘍組和下肢缺血組小鼠建立下肢缺血模型。

1.2.2 小鼠糖尿病模型的建立

造模前，小鼠禁食不禁水8 h，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)溶于pH=4.5的檸檬酸緩沖液，連續(xù)給藥3 d，劑量分別為第一次80 mg/kg、第二次60 mg/kg、第三次80 mg/kg。繼續(xù)飼養(yǎng)1周后尾部采血檢測血糖(重復3次)，隨機血糖 > 16 mmol/L 或空腹血糖11.1 mmol/L 認定為糖尿病小鼠模型成功。

1.2.3 小鼠下肢缺血模型的建立

糖尿病模型建立成功后，糖尿病下肢潰瘍組和下肢缺血組小鼠采用高位結(jié)扎股動脈、股靜脈并斷離股動脈的方法建立下肢缺血模型，糖尿病組小鼠僅采用假手術(shù)處理，術(shù)后無動物死亡。

小鼠使用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為0.25 mL/10 g，待小鼠肌肉松弛，四肢無活動，觸碰胡須無反應時，將小鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，用脫毛膏去除雙下肢鼠毛，75%酒精消毒皮膚，右下肢為手術(shù)區(qū)，在體視顯微鏡下近卵圓窩處剪開皮膚，暴露股動脈，分離伴行靜脈和神經(jīng)，用 4 ～ 0 絲線結(jié)扎股動脈和靜脈，在近膝關(guān)節(jié)處動脈分叉上端也相應結(jié)扎血管，剝離血管，用眼科剪離斷動脈，無菌棉球按壓止血5 min，然后用 6 ～ 0 線縫合皮膚，75%酒精消毒一遍，俯臥置于37℃恒溫電熱毯上保溫30 ～ 60 min至小鼠蘇醒。

1.2.4 指標觀察和檢測

(一)一般體征觀察

動物分別于糖尿病造模前，下肢缺血手術(shù)前，術(shù)后第7、14、21天稱量體重。手術(shù)后第14天，觀察小鼠肢體缺血情況，用以下評估參考分值來判斷：膚色、皮溫未發(fā)生明顯改變計0分；壞死局限于腳趾計1分；壞死局限于足背計2分；壞死局限于小腿計3分；壞死范圍波及大腿以上計4分。

(二)激光多普勒檢測

激光多普勒血流成像儀分別于缺血手術(shù)術(shù)前，術(shù)后第0、3、7、14、21天動態(tài)監(jiān)測各組小鼠下肢血流變化情況，取缺血部位平均灌注量/正常部位平均灌注量進行統(tǒng)計分析。

使用激光多普勒血流成像儀掃描，每只小鼠記錄約為20 s。小鼠麻醉后放在37℃恒溫墊上保持體溫，并去除下肢新生鼠毛，待小鼠循環(huán)呼吸平穩(wěn)后仰臥固定于檢測墊上，未手術(shù)左下肢為參照，計算右下肢相對血流灌注情況。檢測完成后俯臥置于37℃恒溫電熱毯上保溫30 ～ 60 min至小鼠蘇醒。

(三)組織取材

缺血手術(shù)第21天，過量麻醉處死動物，取腓腸肌，中性福爾馬林固定、常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片。進行HE染色，CD31及SMA免疫組化染色。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般體征與體重變化

糖尿病下肢潰瘍組和糖尿病組小鼠在造模成功后，能出現(xiàn)典型的“三高一低”糖尿病癥狀。缺血術(shù)后第21天，糖尿病下肢潰瘍組存活28只，下肢缺血組存活27只，糖尿病組存活29只。如圖1所示，注射STZ后，糖尿病下肢潰瘍組和糖尿病組體重略有增加，但不明顯；缺血術(shù)后7 d，三組小鼠體重皆有下降，糖尿病下肢潰瘍組變化最大；術(shù)后第14天，三組小鼠體重開始增長，下肢缺血小鼠體重增長最快；術(shù)后第21天，只有下肢缺血組小鼠體重繼續(xù)增長，其余兩組都有不同程度體重下降，其中糖尿病下肢缺血組下降更明顯，甚至較缺血術(shù)后仍有很大程度下降。

2.2 缺血下肢壞死評價

下肢缺血手術(shù)后第14天，小鼠缺血腿會發(fā)生不同程度壞死(見圖2)，并評價小鼠下肢缺血壞死程度，標準如下：膚色、皮溫未發(fā)生明顯改變計0分；壞死局限于腳趾計1分；壞死局限于足背計2分；壞死局限于小腿計3分；壞死范圍波及大腿以上計4分。

術(shù)后第14天，各組評分情況如表1所示。糖尿病下肢潰瘍組平均評分最高，單純下肢缺血組次之，糖尿病組接近于正常狀態(tài)(見圖3)。糖尿病下肢潰瘍組小鼠多為1分和2分；單純下肢缺血小鼠多為0分和1分(見圖4)。

表1 糖尿病下肢潰瘍組、糖尿病組和下肢缺血組小鼠壞死評分
Table 1 Necrosis scores of mice in diabetic hindlimb ulcer group, diabetic group and hindlimb ischemia group

組別Groupsn0分0 point1分1 point2分2 point3分3 point4分4 point糖尿病下肢潰瘍組Diabetic hindlimb ulcer group28214732下肢缺血組Hindlimb ischemia group27158220糖尿病組Diabetic group29272000

圖3 糖尿病下肢潰瘍組、糖尿病組和下肢缺血組小鼠平均評分Figure 3 Mean scores of mice in diabetic hindlimb ulcer group,diabetic group and hindlimb ischemia group

圖4 糖尿病下肢潰瘍組、糖尿病組和下肢缺血組小鼠評分分布Figure 4 Distribution of scores indiabetic hindlimb ulcer group, diabetic group and hindlimb ischemia group

2.3 下肢血流灌注變化監(jiān)測結(jié)果

為了監(jiān)測糖尿病下肢潰瘍組、下肢缺血組和糖尿病組小鼠在缺血手術(shù)前后下肢血流灌注變化，用激光多普勒成像儀分別于術(shù)前，術(shù)后當天，術(shù)后第3、7、14、21天，監(jiān)測小鼠下肢的血流情況(見圖5)。

由各時間點多普勒血流灌注變化可知，糖尿病組小鼠下肢并未出現(xiàn)明顯血流變化；下肢缺血組和糖尿病下肢潰瘍組小鼠，術(shù)后缺血肢血流明顯減弱，說明下肢缺血模型建立成功。術(shù)后，缺血肢皆有不同程度的恢復。單純下肢缺血小鼠組的程度明顯優(yōu)于糖尿病下肢缺血組。如圖5所示，術(shù)后第14天，下肢缺血組的血流灌注已比較充分，第21天幾乎完全恢復。而糖尿病下肢潰瘍組，術(shù)后第7、14、21天，恢復都不顯著，甚至有加重趨勢。用手術(shù)肢(右腿)/健全肢(左腿)的比率表示缺血下肢的血流灌注比，如圖6所示，術(shù)后糖尿病下肢潰瘍組和下肢缺血組的灌注比都明顯下降，術(shù)后灌注比都有顯著恢復下肢缺血組略好于糖尿病下肢潰瘍組。第14天下肢缺血組灌注比繼續(xù)恢復，第21天接近于正常，而糖尿病下肢缺血組灌注比卻有明顯下降。糖尿病組全程灌注比幾乎不發(fā)生變化。

2.4 缺血下肢組織病理改變

術(shù)后第21天，取手術(shù)肢(右腿)腓腸肌HE染色(圖7A)：下肢缺血造模21 d后，糖尿病下肢潰瘍組和下肢缺血組肌肉組織結(jié)構(gòu)破壞，肌纖維呈現(xiàn)出明顯的間隙，有炎癥細胞浸潤。其中，糖尿病下肢潰瘍組肌肉組織結(jié)構(gòu)破壞更加嚴重，間隙更明顯。而糖尿病組肌肉組織變化不明顯，結(jié)構(gòu)未破壞。CD31存在于內(nèi)皮細胞內(nèi)，可用于評估血管新生。如圖7B所示，糖尿病下肢潰瘍組和下肢缺血組肌肉組織中，CD31表達明顯，而糖尿病組幾乎沒有表達。如圖7C所示，SMA在糖尿病下肢潰瘍組和糖尿病組的肌肉組織都有顯著的表達，而下肢缺血缺血組表達不明顯，提示SMA的表達可能與糖尿病相關(guān)。

圖5 糖尿病下肢潰瘍組、糖尿病組和下肢缺血組小鼠血流變化Figure 5 Changes of blood flow in diabetic hindlimb ulcer group, diabetic group and hindlimb ischemia group

圖6 糖尿病下肢潰瘍組、糖尿病組和下肢缺血組小鼠血流灌注比變化Figure 6 Changes of blood perfusion ratio in diabetic hindlimb ulcer group, diabetic group and hindlimb ischemia group

圖7 糖尿病下肢缺血組、糖尿病組和下肢缺血組小鼠手術(shù)肢腓腸肌HE染色(A)，CD31(B)和SMA(C)表達Figure 7 HE staining(A), CD31(B) and SMA(C) expression in the gastrocnemius muscle of operated limbs of mice in diabetic hindlimb ulcer group, diabetic group and hindlimb ischemia group

3 討論

糖尿病外周血管病變(peripheral arterial disease，PAD)是導致糖尿病足潰瘍，下肢截肢的主要原因。糖尿病足作為糖尿病常見的難治性慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率高達25%[4]。目前，臨床上PAD的治療有很大的局限性，外科旁路手術(shù)或血管內(nèi)介入無法處理糖尿病下肢廣泛又彌漫性血管狹窄、閉塞。對于缺乏代償性側(cè)支的患者，采用任何手段都難使血管再通[5]。糖尿病血管病變的發(fā)病機理復雜，確切的分子病因和發(fā)病機制仍未完全闡明[6]。因此，仍需進一步研究糖尿病外周血管病變的機制，探索新的有效治療方法。建立可靠的由缺血引起的下肢潰瘍動物模型是研究PAD發(fā)病機制，評價其治療方法的基礎。目前，常用的動物模型可分為模擬病理因素和模擬臨床病征的動物模型兩大類[7]。由于糖尿病動物自發(fā)病變形成足部潰瘍耗時較長，不確定因素大，因此人為的阻斷下肢血供從而造成缺血是構(gòu)建下肢潰瘍模型有效而可行的方法之一。小鼠下肢缺血模型造模方法有很多，根據(jù)不同的需要，模型可分為暫時性缺血和永久性缺血。永久性缺血模型又可以分為結(jié)扎切除法和縮窄栓塞法[8]。本實驗在前期的研究中發(fā)現(xiàn)采用高位結(jié)扎股動脈、股靜脈并斷離股動脈的方法建立下肢缺血模型，肢體缺血明顯、穩(wěn)定且持久，對小鼠的創(chuàng)傷較小。腹腔注射STZ是常用的建立糖尿病模型的方法，給藥連續(xù)3 d后，小鼠便出現(xiàn)“三多一少”的糖尿病典型癥狀，連續(xù)3次隨機血糖 >16或空腹血糖≥11.1 mmol/L 認定為糖尿病小鼠模型成功。

體重的變化可以反應小鼠的生理狀況和缺血恢復。實驗顯示，糖尿病造模成功后，糖尿病小鼠體重變化不明顯，增幅略小于正常小鼠。缺血術(shù)后，小鼠體重都有顯著下降；術(shù)后7 d，各組小鼠體重都有明顯的回升；術(shù)后第14天，糖尿病下肢潰瘍組體重卻有顯著的降低，甚至較術(shù)后低值仍有下降，而下肢缺血組體重逐漸恢復到正常水平。顯然糖尿病下肢潰瘍小鼠受到了糖尿病和下肢缺血的共同影響，恢復較下肢缺血小鼠差。這說明下肢缺血能在短期內(nèi)對小鼠造成損傷，但機體能在短時間內(nèi)自我修復；而糖尿病并發(fā)下肢缺血對小鼠的損傷更大，短時間無法恢復，甚至可能造成二次損傷。

肢體壞死是缺血的嚴重病癥表現(xiàn)，通常壞死和潰瘍也是同時存在的。糖尿病下肢潰瘍組小鼠缺血肢基本都有不同程度的壞死，且多數(shù)壞死波及腳掌以及腳掌以上；下肢缺血組多數(shù)已經(jīng)復原，壞死也僅限于腳趾。Kant等[9]發(fā)現(xiàn)使用經(jīng)典的抗炎、抗氧化藥物姜黃素能提高抗氧化酶和抗炎因子的水平，在修復糖尿病潰瘍上有較大應用前景。我們也在實驗中發(fā)現(xiàn)，僅限于腳趾的潰瘍是可以恢復的，但潰瘍壞死波及到腳掌及以上是很難恢復的，甚至可能發(fā)生肢體壞死脫落，這可能與小鼠自身的抗炎抗氧化能力有關(guān)。

持續(xù)肢體缺血的動物模型必須具備以下4個條件[10]：(1)出現(xiàn)一定程度的缺血；(2)缺血可以保持一段時間；(3)缺血可以通過實驗測得的數(shù)值所證實；(4)缺血的肢體和正常的肢體可以進行比較。多普勒血流監(jiān)測結(jié)果顯示，糖尿病下肢潰瘍和下肢缺血小鼠術(shù)后第0、3、7天缺血明顯；術(shù)后第14、21天，下肢缺血小鼠血供趨于正常，而糖尿病下肢潰瘍小鼠仍明顯可見血供不足。這說明糖尿病下肢潰瘍小鼠缺血時間長，自體恢復差，該模型缺血明顯且穩(wěn)定。本實驗用手術(shù)肢(右腿)/健全肢(左腿)的比率顯示血流變化，這樣可以排除環(huán)境和動物個體差異。結(jié)果顯示，缺血術(shù)后，糖尿病下肢潰瘍組和下肢缺血小鼠患肢血流都有顯著的增加，可能是機體對缺血的反應，是缺血肢側(cè)支循環(huán)的重建和再通。術(shù)后第14、21天，下肢缺血組血流繼續(xù)恢復，并接近正常狀態(tài)；糖尿病下肢潰瘍組卻趨于平臺期，甚至有所惡化。手術(shù)肢腓腸肌病理切片顯示糖尿病下肢潰瘍組和下肢缺血組肌肉組織結(jié)構(gòu)破壞，并有炎癥細胞浸潤，糖尿病下肢潰瘍組肌肉組織結(jié)構(gòu)破壞更嚴重。CD31存在于內(nèi)皮細胞內(nèi)，用于評估血管新生。免疫組化結(jié)果顯示糖尿病下肢潰瘍組和下肢缺血組肌肉組織都有CD31表達，下肢缺血組CD31表達量高于糖尿病下肢潰瘍組，說明糖尿病可能阻礙了血管新生。有研究表示[11]：糖尿病導致的外周血管病變會使局部缺血缺氧，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達量下降，造成傷口久治不愈。SMA表達體現(xiàn)了平滑肌細胞的增殖，本實驗顯示，SMA的表達和下肢缺血無明顯相關(guān)，但與糖尿病有密切關(guān)系，可能在糖尿病導致的外周血管病變中，平滑肌細胞增殖阻礙了血管新生，進而影響側(cè)支循環(huán)的恢復，造成患肢繼續(xù)缺血潰瘍壞死。

糖尿病潰瘍的發(fā)病是由血管病變、神經(jīng)病變、感染和其他多種致病因素綜合作用的結(jié)果[12]。本動物模型誘發(fā)糖尿病發(fā)生并繼發(fā)下肢缺血，能很好的模擬臨床誘導自發(fā)性的糖尿病下肢潰瘍、糖尿病足，穩(wěn)定而持久。結(jié)合多普勒血流監(jiān)測和壞死評價，便于定量分析，可信度高，成模率較高，可以用于糖尿病導致的外周血管病變、糖尿病足的發(fā)病機制研究和治療藥物的篩選。但本模型建立的是急性下肢缺血，可能與臨床糖尿病引起的慢性缺血造成的糖尿病足有所區(qū)別，仍需要對模型進行改進使之更貼近于臨床。