蔡磊,李建軍,余露軍,黃韌
(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所,廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510663)
魚類作為水生態(tài)系統(tǒng)和低等脊椎動(dòng)物的典型代表,具有種類多、繁殖力強(qiáng)、遺傳容易控制、飼育設(shè)施要求簡單等諸多優(yōu)點(diǎn),在發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)等研究領(lǐng)域具有不可替代優(yōu)勢(shì)。僅國際斑馬魚模式生物數(shù)據(jù)庫(ZFIN)中注冊(cè)的斑馬魚實(shí)驗(yàn)室已達(dá)1304個(gè)(2019年5月,https://zfin.org),我國利用斑馬魚開展科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室超過250個(gè)[1],目前全球以斑馬魚為代表的實(shí)驗(yàn)魚使用量呈逐年上升趨勢(shì)[2]。由于我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)科建設(shè)整體起步較晚[3],尤其實(shí)驗(yàn)魚培育管理更滯后于哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,國內(nèi)外現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)魚品種品系的來源、代系、培育和管理方式等均較復(fù)雜。為促進(jìn)我國實(shí)驗(yàn)魚的規(guī)范培育,本文綜述了國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)魚的培育管理現(xiàn)狀。
封閉群的定義最早出現(xiàn)在1963年國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)理事會(huì)(The International Council on Laboratory Animal Science,ICLAS)會(huì)議(ICLAS Bulletin No.14),為:“不從外部進(jìn)行引種的群體為封閉群”[4],后ICLAS于1972年發(fā)布了封閉群官方定義,為:“不從外部引種,至少封閉培育4代以上,每代近交系數(shù)上升不超過1%”[5];1992年美國大鼠命名委員會(huì)發(fā)布的大鼠命名規(guī)則中對(duì)封閉群定義仍沿用ICLAS的官方定義[6];我國哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制國家標(biāo)準(zhǔn)(2001版和2010版)中對(duì)封閉群的定義均參考ICLAS,為:“以非近親交配方式進(jìn)行繁殖生產(chǎn)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群,在不從外部引入新個(gè)體的條件下,至少連續(xù)繁殖4代以上的群體”[7];鼠類國際標(biāo)準(zhǔn)化遺傳命名委員會(huì)(International Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice,ICSGNM)2016年發(fā)布的最新修訂《大小鼠命名指南》中對(duì)封閉群定義為:“封閉群為保持有限遺傳多樣性的一個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體,以無選擇的非近親交配方式繁殖,所有的交配僅限于封閉群內(nèi)部個(gè)體之間,且不從外部引進(jìn)新的動(dòng)物”[8]。
以往國內(nèi)外較多書籍[9]、文獻(xiàn)[10]、標(biāo)準(zhǔn)[7]和指南中常將遠(yuǎn)交群(outbred stock)和封閉群概念等同。參照ICSGNM于2016年新發(fā)布的指南,封閉群和遠(yuǎn)交群定義存在本質(zhì)上的區(qū)別,封閉群為保持有限的遺傳多樣性(Contains Limited Genetic Diversity),而遠(yuǎn)交群則為保持最大的遺傳雜合度(Maintain Maximum Heterozygosity)[8]。
封閉群主要特征為在一定范圍內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的遺傳雜合度,維持這種狀態(tài)所需的條件包括:①封閉(不由外部引進(jìn)新基因);②非近交(盡量減少基因丟失);③連續(xù)繁殖4代以上(前幾代遺傳雜合度波動(dòng)較大);④傳代親本數(shù)量較多(降低近交機(jī)率)。因此,推薦實(shí)驗(yàn)魚封閉群定義:“以非近親交配方式繁殖生產(chǎn),不從外部引入新基因,至少連續(xù)繁殖4代以上的實(shí)驗(yàn)魚種群”。同時(shí)結(jié)合親本數(shù)量要求,如傳代親本應(yīng)保持50對(duì)以上,以滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群的本質(zhì)要求。
與封閉群定義相比,國內(nèi)外對(duì)近交系的定義較為一致,為:“經(jīng)過連續(xù)20代以上的全同胞兄妹交配或親子交配,品系內(nèi)所有個(gè)體都可以追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對(duì)共同祖先,近交系數(shù)大于99%,且群體內(nèi)任何個(gè)體基因組中98.6%以上的等位位點(diǎn)為純合”[2-3, 6]。因?qū)嶒?yàn)魚與哺乳類遺傳規(guī)律相似,國際上已按照哺乳類近交系培育方法成功培育出多個(gè)實(shí)驗(yàn)魚近交系(表1)。
以大小鼠為代表的哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群理論體系已獲國內(nèi)外廣泛認(rèn)可。實(shí)驗(yàn)魚與哺乳類同為脊椎動(dòng)物,生殖方式相似,共同遵守遺傳分離、自由組合和連鎖定律,且實(shí)驗(yàn)魚封閉群建群過程中基因頻率變化規(guī)律與哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相同。因此,哺乳類封閉群理論體系也同樣適用于實(shí)驗(yàn)魚,目前國內(nèi)外已按照哺乳類封閉群的概念和培育管理方法,成功育成多個(gè)魚類封閉群。
目前國際上實(shí)驗(yàn)魚封閉群培育規(guī)模最大的為日本青鳉(Oryziaslatipes),已報(bào)道封閉群超過50個(gè)[11],如Kunming,Nagoya,Toyohashi等。斑馬魚(Daniorerio)至今報(bào)道的封閉群有AB[12]、TU[13]、TL[13]、IN(India)[14]、EKK[15]、WIK[16]、Darjeeling(DAR)[17]、NHGR-1[18]、IM12m[19],IM14m[19]、Florida wt line[20],Light-colored[21]等。其中AB、TU、TL、WIK、IN、Darjeeling和NHGR-1等原始建群方式未嚴(yán)格遵照標(biāo)準(zhǔn)封閉群建群要求,如AB系有孤雌生殖背景;TU為利用近交移除胚胎期致死突變得來;TL為篩選leo和lof基因純合得來;WIK來源野生群,經(jīng)挑選單次產(chǎn)卵量最大的一對(duì)魚作為原始群建立;IN來源于印度東北部野生群,經(jīng)過3代近交后再回交得來;DAR來源印度Darjeeling地區(qū),1987年后于美國俄勒岡大學(xué)保種;NHGR-1來源于AB × TU繁殖的后代TAB-5,在TAB-5近親繁殖的F1代中挑選繁殖量最大的親本作為NHGR-1的第一代,這些群體有人認(rèn)為是遠(yuǎn)交群或非近交群(outbred line/ outbred strain/ non-inbred strains),也有人認(rèn)為是封閉群[22],因此,其不是嚴(yán)格意義上的封閉群動(dòng)物。但I(xiàn)M12 m、IM14 m、EKK、Florida wt line和Light-colored等為按照封閉群要求育成。此外,其它實(shí)驗(yàn)魚也有多個(gè)封閉群報(bào)道,如劍尾魚屬的新月魚(Xiphophoursmaculatus)2856品種(1971)、劍尾魚(Xiphophourshellerii)501品種(1963)、2977品種(1963)和3062品種(1971)等[23],孔雀魚(Poeciliareticulata)S、S3HR、SC和F22等16個(gè)封閉群[24-25]。
國內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚封閉群培育方面,廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所培育了我國第一個(gè)海水實(shí)驗(yàn)魚封閉群—諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)封閉群,現(xiàn)已達(dá)第19代[26- 27];中國科學(xué)院水生生物研究所培育了稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)封閉群,現(xiàn)已培育至第10代[28-29]。
在魚類封閉群培育上,總體上,發(fā)達(dá)國家優(yōu)于我國,淡水優(yōu)于海水,一些由于歷史原因?qū)е卤尘拜^為復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)魚群,如斑馬魚AB系等,繁殖管理方式已接近封閉群,后續(xù)如嚴(yán)格控制繁殖方式(避免近親交配等)、保持群體規(guī)模、避免外源基因引入,則可培育成相對(duì)規(guī)范的封閉群。
哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系已有上百年培育歷史,僅小鼠近交系就達(dá)450多種[30],最高近交代數(shù)超過210代[31]。魚類采用全同胞兄妹交配方式(full-sibling pair)培育近交系也已有50年以上的歷史。斑馬魚已見報(bào)道近交系6個(gè),分別為C32、sjA、sjC、sjD、IM和May。其中C32和IM為高度純合的近交系。C32[15]來源于封閉群AB,最初通過雌核發(fā)育獲得,1991年后以嚴(yán)格全同胞兄妹交配方式傳代;IM和May為利用全同胞兄妹交配方式培育,IM已達(dá)20代以上[32],May已達(dá)第16代[32];sjA、sjC、sjD均為Stephen L. Johnson實(shí)驗(yàn)室培育[33],分別來源于AB、C32和DAR。
日本青鳉20代以上的近交系已有13個(gè),分別為HBI-I、HNI-II、HO4C、HO5、HdrR、NCMH、HB32D、HB11 A、Kaga、Hsok、AA2、Cab和Hi3,其中HO4C品系近交代數(shù)已達(dá)到100代(表1)。
劍尾魚屬已育成近交系超過12個(gè),分別為X.alvarezi, Dolores、X.couchianus、X.helleri, Cd、X.helleristrigatus、X.helleriguentheri、X.hellerihelleri、X.maculatus, Jp 163 A、X.maculatus, Jp 163 B、X.montezumaecortezi、X.signum、X.variatus和X.xiphidium。國際劍尾魚種質(zhì)資源中心(TheXiphophorusGenetic Stock Center)現(xiàn)保藏劍尾魚屬(Xiphophorus)近交有6個(gè),分別為X.maculatus, Jp 163 A、X.maculatus, Jp 163 B、X.helleri, Cd、X.alvarezi, Dolores、X.couchianus和X.signum,其中Jp 163 A近交代數(shù)已超過100代(表1)。
孔雀魚(P.reticulata)已報(bào)到近交系有8個(gè)[34],分別為MAC,BDZW1,BDZW2,Armatus,Guanapo,Quare6,Quare6 family II 215-3和Cumaná,其中Maculatus, BDZW1, BDZW2和Armatus品系均于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)近交繁殖超過50年。
孤獨(dú)擬胎鳉(Poeciliopsislucida)近交系超過63代[35];光亮擬胎鳉(Poeciliopsismonacha)有2個(gè)近交系[35],分別為S68-4和S68-5,近交代數(shù)分別為34和30。
除此之外,還有通過雌核發(fā)育和自體受精產(chǎn)生的純系魚類,如亞馬遜花鳉(Poeciliaformosa)和紅樹林鳉(Kryptolebiasmarmoratus和Kryptolebiashermaproditus)。亞馬遜花鳉野生狀態(tài)下幾乎全為雌性,繁殖時(shí)雌魚通過利用近緣種精子激活卵子,從而完成雌核發(fā)育,近緣種精子中遺傳物質(zhì)不參與受精發(fā)育[36]。兩種紅樹林鳉[37]為目前在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的僅有的2種通過自體受精繁殖后代的物種,群體中絕大部分個(gè)體同時(shí)具有成熟的精巢和卵巢,通過自體受精完成繁殖后代。
國內(nèi)魚類近交系培育方面,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所培育了5個(gè)劍尾魚(X.helleri)近交系,分別為RR-B、RW-H、RW-K、BW-D和BY-F,其中RR-B近交系已達(dá)26代以上[38],中國科學(xué)院水生生物研究所培育的稀有鮈鯽近交系HAN已達(dá)33代以上[29],廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所培育了4個(gè)諸氏鯔蝦虎魚(M.chulae)近交系,最高代數(shù)已達(dá)到第13代[26]。南華大學(xué)利用連續(xù)雌核發(fā)育方法培育了實(shí)驗(yàn)紅鯽(Carassiusauratusred variety)純系[39]。各品系近交系近交代數(shù)及參考文獻(xiàn)見表1。
綜上所述,國內(nèi)外在實(shí)驗(yàn)魚近交系培育上均開展了大量工作,已育成多個(gè)近交20代以上的近交系,但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)個(gè)別魚類近交系在培育過程中存在生命力和生殖力下降等近交衰退現(xiàn)象。針對(duì)此問題,國內(nèi)外采取了諸多用于控制或減輕衰退的措施,如Shinya等[19]通過對(duì)斑馬魚近交系親本的繁殖能力進(jìn)行篩選,將繁殖力最強(qiáng)的斑馬魚作為傳代親本,用于保持近交系群體的繁殖力;吳淑勤等[38]通過創(chuàng)造適宜養(yǎng)殖環(huán)境、強(qiáng)化親魚營養(yǎng)條件和加強(qiáng)管理等措施克服劍尾魚近交衰退。由于近交系衰退主要由遺傳導(dǎo)致,因此在培育過程中加強(qiáng)人工選育和飼養(yǎng)管理對(duì)控制近交衰退尤為重要,人工選育可有效避免有害基因在群體中的傳遞,可在源頭上排除對(duì)生殖力產(chǎn)生危害的基因,加強(qiáng)養(yǎng)殖管理可為實(shí)驗(yàn)魚創(chuàng)造良好的生存環(huán)境,避免外界不利因素對(duì)實(shí)驗(yàn)魚生長發(fā)育產(chǎn)生影響。
表1 實(shí)驗(yàn)魚近交系統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of inbred strain of laboratory fish
哺乳動(dòng)物封閉群繁殖方法通常有最佳避免近親交配法、循環(huán)交配法或隨機(jī)交配法[7],在繁殖過程中,保持有效群體大小為雌雄各25尾,是保證傳代過程中近交系數(shù)上升不超過1%的最小群體規(guī)模。由于魚類個(gè)體小、單次繁殖量大,繁育成本低,在封閉群維持過程中,較易維持一個(gè)規(guī)模超過100對(duì)以上的群體,因此,實(shí)驗(yàn)魚封閉群繁殖管理中,引種數(shù)量可適當(dāng)提高,如50對(duì)以上,可選隨機(jī)交配法傳代。近交系常用的繁殖方法有親子交配(parent-offspring)、全同胞兄妹交配(full-sib)、半同胞兄妹交配(half-sib)、雙堂兄妹交配(double first cousin),其中全同胞兄妹交配為最經(jīng)典和最常采用方式。按照全同胞兄妹交配方式培育實(shí)驗(yàn)魚近交系已經(jīng)有近50年歷史,目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)魚近交系均通過此法獲得[38, 40, 42, 44]。由于多數(shù)魚類具有體外受精發(fā)育特點(diǎn),魚類也可利用雌核發(fā)育獲得純合后代,如實(shí)驗(yàn)紅鯽純系通過連續(xù)2代進(jìn)行雌核發(fā)育獲得、斑馬魚C32近交系的培育同時(shí)采用了雌核發(fā)育和全同胞兄妹交配。
與陸生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比,水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展相對(duì)滯后,水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育理論體系及相應(yīng)方法亦較多參考陸生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。水生和陸生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雖在受精方式上差別巨大,如魚類多數(shù)為體外受精發(fā)育(斑馬魚等)、也有體內(nèi)受精(劍尾魚等)或自體受精方式(紅樹林鳉等),但在封閉群培育上,二者遺傳結(jié)構(gòu)的變化均同屬群體遺傳學(xué)范疇,規(guī)律相似,在近交系培育過程中,二者等位基因純合規(guī)律也一致。因此實(shí)驗(yàn)魚封閉群和近交系培育方法可借鑒陸生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方法,而在具體操作細(xì)節(jié)上在確保符合要求的前提下可根據(jù)魚類生理特征進(jìn)行調(diào)整。
實(shí)驗(yàn)魚的長期維持是一個(gè)非常系統(tǒng)和復(fù)雜的工程,培育過程中遺傳物質(zhì)的傳遞受到諸多因素影響,如封閉群和近交系培育過程中面臨的遺傳污染、遺傳突變、遺傳漂變、近親繁殖以及人為選擇等,良好的實(shí)驗(yàn)魚繁育管理需對(duì)影響遺傳信息的各種因素進(jìn)行考慮并建立相應(yīng)應(yīng)對(duì)措施。
3.2.1 封閉群
在新建封閉群的管理上,需對(duì)其原始建群親本進(jìn)行嚴(yán)格的種質(zhì)鑒定,確保種類準(zhǔn)確無誤,并建立詳細(xì)的原始引種記錄檔案,包括種名、來源、數(shù)量、雌雄比例、種質(zhì)鑒定結(jié)果、繁殖方法等,原始建群親本一般不少于50對(duì);一旦確立原始建群親本,立即封閉群體,確保群體的繁殖僅限于群體內(nèi)部,在封閉的條件下至少連續(xù)繁殖4代以上,并進(jìn)行詳細(xì)的傳代譜系記錄;在培育過程中,利用分子標(biāo)記等方法,定期對(duì)其遺傳雜合度和群體遺傳平衡狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè),以確保封閉群實(shí)驗(yàn)魚的基因異質(zhì)性及多態(tài)性[7]。
3.2.2 近交系
近交系必須有完整的繁殖記錄,包括來源、品系名稱、近交代數(shù)及主要生物學(xué)特征等;培育過程需嚴(yán)格控制繁殖方法,基礎(chǔ)群嚴(yán)格按照全同胞兄妹交配繁育,用于種群的傳代,生產(chǎn)群在繁殖代數(shù)4代以內(nèi)可采用隨機(jī)交配,另外,規(guī)范的命名方法是保證繁殖譜系可溯源的重要依據(jù),確保每一箱實(shí)驗(yàn)魚都有唯一且可溯源的編號(hào),不同養(yǎng)殖單元的實(shí)驗(yàn)魚應(yīng)有明確的識(shí)別信息,包括品種/品系名稱、來源、父母系資料、出生或引入日期、數(shù)量等;定期監(jiān)測(cè)遺傳純合度是保證近交系培育遺傳純合度的重要手段。綜上所述,實(shí)驗(yàn)魚近交系遺傳管理的核心在于保持動(dòng)物的同基因性以及基因純和性[7]。
在實(shí)驗(yàn)魚的飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)化上,因管理理念的差異,國外較偏重于制訂指南或準(zhǔn)則,如聯(lián)合國糧農(nóng)組織[45]、加拿大動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)[46]、英國皇家防止虐待動(dòng)物協(xié)會(huì)[47]等均制定了關(guān)于魚類養(yǎng)殖管理的指南,此外還有一些實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)管理的經(jīng)典書籍,如《The laboratory fish》[48]和《The zebrafish book》[49]等。因上述指南和書籍多為原則性要求和建議,在實(shí)際操作過程中各實(shí)驗(yàn)魚生產(chǎn)和使用單位較難達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)管理,如通過公共網(wǎng)絡(luò)途徑獲得的美國Washington、Southflorida和Rosalind Franklin等大學(xué)斑馬魚飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(standard operating procedures,SOP),詳盡程度、具體操作指標(biāo)設(shè)置以及管理措施等均差別較大。
與國外相比,我國在實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)化上稍顯滯后,通過對(duì)我國19個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)魚生產(chǎn)和使用單位實(shí)地調(diào)研,各實(shí)驗(yàn)室的飼養(yǎng)管理SOP均是在參考國外書籍、指南或SOP等,并結(jié)合各自實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)上制定。在標(biāo)準(zhǔn)制定上,2009年國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)批準(zhǔn)廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所起草《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 魚類環(huán)境與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》國家標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)20091329-T-469);2013年12月20日北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布了實(shí)驗(yàn)用魚質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)(包括實(shí)驗(yàn)用魚微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、遺傳質(zhì)量控制、配合飼料、環(huán)境條件、病理診斷6個(gè)部分);2016年8月10日,稀有鮈鯽質(zhì)量控制系列標(biāo)準(zhǔn)(微生物、寄生蟲、遺傳、營養(yǎng)和飼料)獲得湖北省地方標(biāo)準(zhǔn)制定立項(xiàng);2016年12月29日湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)發(fā)布了《實(shí)驗(yàn)魚類 實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系遺傳質(zhì)量控制》。隨著實(shí)驗(yàn)魚的應(yīng)用領(lǐng)域和影響力逐漸增大,雖然我國在實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制上開展了大量研究工作,標(biāo)準(zhǔn)化工作也取得部分進(jìn)展,但仍與我國較大的實(shí)驗(yàn)魚培育應(yīng)用規(guī)模不匹配,標(biāo)準(zhǔn)化工作急需加強(qiáng)。
魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源經(jīng)過幾十年的快速發(fā)展,培育了眾多不同生物學(xué)特性的品種和品系,建立了豐富的疾病和毒理應(yīng)用模型,取得了一大批重要的新發(fā)現(xiàn)和新進(jìn)展,有力支撐和推動(dòng)了生命科學(xué)的發(fā)展。同時(shí)也應(yīng)注意到,魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育和應(yīng)用過程中仍然面臨著標(biāo)準(zhǔn)化不足等問題,如我國暫無可用的實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制國家標(biāo)準(zhǔn),目前絕大部分省份未將實(shí)驗(yàn)魚納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)管理體系,導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)魚培育技術(shù)、管理水平以及質(zhì)量上良莠不齊,因此非常有必要通過加強(qiáng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定,以規(guī)范和引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)魚培育和管理,對(duì)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)魚行業(yè)的發(fā)展有重要意義。