諸氏鯔蝦虎魚封閉群遺傳質(zhì)量評價方法的建立

蔡磊，李建軍，余露軍，黃韌

(廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)是我國本土一種小型海水魚類，在繁殖生物學(xué)[1]、細(xì)胞生物學(xué)[2]、遺傳學(xué)[3]以及毒理學(xué)[4]等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究均表明，諸氏鯔蝦虎魚是一種比較優(yōu)良的海水實驗魚類，如個體小、繁殖周期短、繁殖力強、便于實驗室內(nèi)飼養(yǎng)管理以及對污染物毒性敏感等。諸氏鯔蝦虎魚現(xiàn)已初步完成實驗動物化研究，封閉群繁殖至第19代，近交系培育至第13代，且于全國30個省市推廣應(yīng)用，廣泛用于石油開發(fā)污染物、船舶壓載水、疏浚泥、重金屬等污染物的生物毒性評價以及疾病模型研究等領(lǐng)域[5]。因海水魚類特殊的生活環(huán)境，小型海水魚標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控體系的建立仍是公認(rèn)難題，尤其在遺傳質(zhì)量評價上，國內(nèi)外的研究均相對薄弱。而在實驗動物研究領(lǐng)域中，遺傳背景清晰又是其最基本和最重要的條件要求，建立遺傳質(zhì)量評價技術(shù)是實現(xiàn)其標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化管理的重要手段。諸氏鯔蝦虎魚作為一種潛在的海洋模式魚類，建立其遺傳質(zhì)量評價方法，對規(guī)范今后引種、保種、性狀控制和飼養(yǎng)管理等具有重要實用價值，也有利于打造我國特色海洋模式魚類品牌，促進(jìn)我國海洋魚類的資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為科研優(yōu)勢。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有分布廣、共顯性、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，在遺傳學(xué)研究上已經(jīng)獲得廣泛應(yīng)用[6-8]，國際實驗動物學(xué)會(International Council for Laboratory Animal Science， ICLAS)[9]和Charles River等[10]均推薦微衛(wèi)星標(biāo)記作為實驗動物遺傳質(zhì)量監(jiān)測的工具。近年來利用微衛(wèi)星標(biāo)記對實驗動物封閉群進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測已有較多報道，如大小鼠[11]、小型豬[12]、樹鼩[13]、稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)[14]等封閉群動物相繼建立了基于微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的遺傳質(zhì)量評價方法。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記分別對諸氏鯔蝦虎魚封閉群和野生群進(jìn)行了遺傳質(zhì)量評價，以期建立諸氏鯔蝦虎魚封閉群遺傳質(zhì)量評價方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

諸氏鯔蝦虎魚樣本分別為實驗室繁殖的第14代封閉群，平均體重為(0.65 ± 0.16)g；和廣東省深圳大鵬灣海域采集的野生群體，平均體重為(0.85 ± 0.36)g。其中，封閉群和野生群樣本數(shù)量各為50尾(雌雄各半)。

1.2 方法

1.2.1 樣本基因組DNA提取

參照北京天根動物基因組DNA抽提試劑盒說明書的方法提取樣品基因組DNA并檢測濃度和純度，取出部分DNA樣本將濃度調(diào)至50 ng/uL，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物

參考文獻(xiàn)[15]和Genebank數(shù)據(jù)庫選取20個多態(tài)性較好的微衛(wèi)星位點用于實驗魚遺傳檢測，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物5’端用FAM或HEX熒光素標(biāo)記，引物信息見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及STR分型

PCR總反應(yīng)體積為25 μL，其中含10 × PCR Buffer 2.5 μL(Mg2+Plus)，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，F(xiàn)AM和HEX標(biāo)記的上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，基因組DNA 50 ng，Taq酶(5 μmol/L)0.2 μL，雙蒸水補齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序為94℃，預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，退火40 s(退火溫度因引物而異)，72℃延伸40 s，30個循環(huán)，最后于72℃下延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用ABI 3730xl遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行分型，原始峰圖用GeneMapper 4.0基因分型軟件(Applied Biosystems，美國)讀取分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用Popgene32(Version 1.31)軟件統(tǒng)計分析微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)和無偏期望雜合度(He)。根據(jù)Botstein等[16]的方法計算每個微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量(PIC)，計算公式如下：

式中，Pi、Pj分別為群體中第i和第j個等位基因頻率，n為某一基因座上等位基因數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星分型結(jié)果

統(tǒng)計各位點的STR分型結(jié)果，轉(zhuǎn)換成基因型。20個微衛(wèi)星標(biāo)記均能獲得清晰穩(wěn)定的峰圖。20個位點在100尾封閉群和野生群樣本中共檢測到201個等位基因，平均每個位點檢測到10.05個等位基因，最多的為18個(位點171252)，最少的為3個(位點2347-2)。部分分型結(jié)果見圖1。計算各微衛(wèi)星位點在各群體中的多態(tài)信息含量(PIC)，封閉群除位點1135-1為中度多態(tài)外，其余位點均為高度多態(tài)；野生群除位點2347-2為中度多態(tài)外，其余位點均為高度多態(tài)。

2.2 遺傳多樣性檢測

20個位點在封閉群和野生群中檢測到平均等位基因數(shù)(Na)分別為7.40和9.05；平均觀測雜合度(Ho)分別為0.5790和0.5710、平均無偏期望雜合度(He)分為0.6927和0.7162。諸氏鯔蝦虎魚封閉群和野生群遺傳多樣性均較為豐富，封閉群遺傳多樣性稍低于野生群。具體遺傳參數(shù)見表2。

2.3 封閉群與野生群遺傳結(jié)構(gòu)分析

諸氏鯔蝦虎魚封閉群和野生群F統(tǒng)計量和基因流分析表明(表3)，僅Fis值中有2個位點為負(fù)值，F(xiàn)it和Fst值均為正值，F(xiàn)is正值范圍為0.0069 ～ 0.6338，F(xiàn)it和Fst值范圍分別0.0194 ～ 0.6349和0.0032 ～ 0.1357，三者均值分別為0.1757，0.2142和0.0467。Fst和Fit均值顯示群體內(nèi)個體間的近交程度較低；Fst均值結(jié)果表明封閉群與野生群間遺傳分化較小，封閉群保持較好的遺傳雜合度。對群體基因流Nm值進(jìn)行分析，Nm均值為5.0993(大于1)，表明基因結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。諸氏鯔蝦虎魚野生群和封閉群遺傳相似率和遺傳距離分析結(jié)果顯示，封閉群與野生群保持較高的遺傳相似率(0.7835)和遺傳距離(0.2439)。

表1 諸氏鯔蝦虎魚20個微衛(wèi)星DNA位點信息Table 1 Information of 20 microsatellite DNA loci in Mugilogobius chulae

注：藍(lán)色為樣品；紅色為Marker，從左到右分別為100, 120, 140, 160, 180 bp和200 bp。圖1 位點2073-5在封閉群第5號樣本的分型結(jié)果Note. Blue represents sample. Red represents marker, 100, 120, 140, 160, 180 bp and 200 bp from left to right, respectively.Figure 1 Typing results of locus 2073-5 in sample of closed colony No. 5

表2 諸氏鯔蝦虎魚封閉群和野生群在20個微衛(wèi)星位點上的遺傳參數(shù)
Table 2 Genetic parameters ofMugilogobiuschulaefrom closed colony and wild population at 20 microsatellite loci

位點Locus封閉群Closed colony野生群Wild populationNaHoHePICNaHoHePIC518-470.44000.64140.590390.70000.82420.79161135-170.34000.39290.3674100.64000.80610.77161513-1120.66000.85760.8342100.64000.68650.63921891-1110.60000.86360.8440110.50000.83230.80431997-540.62000.57840.480560.18000.59720.50982073-550.48000.59700.554170.56000.64890.59662152-4100.78000.85270.8255130.88000.83580.80792157-570.62000.55190.519570.64000.73350.68172317-160.56000.64790.585480.48000.58460.53382347-230.66000.63050.545750.54000.52710.44902368-440.60000.62440.552050.36000.60730.53302436-180.70000.78690.7471110.84000.78120.75132489-290.70000.79760.761770.58000.55230.51055980360.34000.76850.7261110.24000.83150.80138292680.48000.68120.623770.40000.66300.59358781950.50000.67330.607650.60000.60340.5392171252150.68000.86340.8425180.62000.90080.882218311190.42000.72440.695390.52000.61290.550836443960.64000.59960.5440100.68000.84040.811342126560.76000.72060.6704120.82000.85540.8303Mean7.40.57900.69270.64599.050.57100.71620.6694

2.4 樣本量對封閉群遺傳多樣性參數(shù)的影響

利用Excel自嵌隨機抽樣方法，分別隨機抽取封閉群中10尾、20尾、30尾、40尾樣本，分別計算10、20、30、40和50尾樣本條件下遺傳參數(shù)(圖2)，平均有效等位基因數(shù)(Ne)、Ho和He在10 ～ 50尾樣本中變化不明顯，Na在30尾樣本后趨于穩(wěn)定。

3 討論

實驗動物的一個重要特征是遺傳背景清晰，我國現(xiàn)行實驗動物遺傳質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)主要推薦生化標(biāo)記方法[17]，由于生化位點攜帶的信息量不多，實驗動物群體需要多態(tài)性更為豐富的標(biāo)記來反應(yīng)其遺傳多樣性[18]。微衛(wèi)星標(biāo)記作為基因組中廣泛分布的一種短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度的多態(tài)性和共顯性特征既可完成實驗動物表型檢測，還可對遺傳雜合度進(jìn)行評估。目前利用微衛(wèi)星標(biāo)記對實驗動物遺傳質(zhì)量進(jìn)行評價已有較多報道[19-20]。本研究利用20個微衛(wèi)星標(biāo)記對諸氏鯔蝦虎魚封閉群和野生群進(jìn)行了遺傳檢測，根據(jù)Botstein等[16]提出的基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)：當(dāng)PIC> 0.5時，該位點為高度多態(tài)性位點；當(dāng)0.25 0.5)。一般情況下，多態(tài)性高的標(biāo)記能提供更多的遺傳信息，本研究所選用的標(biāo)記可較好的反應(yīng)實驗魚的遺傳信息，可滿足實驗魚遺傳質(zhì)量檢測要求。

表3 諸氏鯔蝦虎魚20個微衛(wèi)星位點的F統(tǒng)計量和基因流Table 3 F statistics and gene flow of 20 microsatellite loci in Mugilogobius chulae

封閉群動物與野生動物一個重要區(qū)別為封閉群在一定范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定的遺傳雜合度[21]，而野生群保持了較高雜合度。雜合度為群體遺傳結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，也是評價群體遺傳變異的最直接和有效的方法。一般認(rèn)為，當(dāng)一個群體的平均有效雜合度小于0.5時，表明該群體遺傳多樣性偏低，有近交傾向，當(dāng)平均有效雜合度高于0.7時，遺傳雜合度偏高，群體間個體差異較大，群體的平均有效雜合度在0.5 ～ 0.7之間時才為合格的封閉群動物。目前在基于微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的實驗動物封閉群遺傳質(zhì)量檢測中，多采用遺傳雜合度是否在0.5 ～ 0.7范圍之間作為判定指標(biāo)[19-20]，如王洪等[11]推薦將平均雜合度在0.5 ～ 0.7之間作為合格封閉群大小鼠的評價指標(biāo)；李薇等[22]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對5個長爪沙鼠封閉群遺傳檢測發(fā)現(xiàn)，平均有效雜合度0.5 ～ 0.7區(qū)間范圍可作為長爪沙鼠封閉群遺傳合格與否的量化指標(biāo)；孫瑞萍等[12]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對封閉群五指山豬遺傳質(zhì)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)封閉群遺傳雜合度為0.69，符合封閉群動物特征，可用于五指山小型豬遺傳多樣性評估。

由于國內(nèi)外在魚類封閉群培育上起步較晚，目前關(guān)于實驗魚封閉群微衛(wèi)星遺傳質(zhì)量檢測的報道相對較少，國內(nèi)僅見顧黨恩等[14]和李慧慧等[23]分別利用微衛(wèi)星標(biāo)記對稀有鮈鯽連續(xù)代系封閉群(P0，F(xiàn)1 ～ F8)的遺傳質(zhì)量進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)遺傳雜合度均在0.5 ～ 0.7之間。本研究中諸氏鯔蝦虎封閉群和野生群平均無偏期望雜合度分別為0.6927和0.7162，封閉群平均無偏期望雜合度在0.5 ～ 0.7范圍之間，而野生群平均期望雜合度在0.7以上。如無發(fā)生近交，魚類野生群體遺傳雜合度通常高于0.7，如鳙(Aristichthysnobilis)為0.882[24]、黃鰭棘鯛(Acanthopagruslatus)為0.741[25]、擬鯉(Rutilusrutilus)為0.9168[26]、鱖(Sinipercachuatsi)為0.71[27]等?？梢娖骄鶡o偏期望遺傳雜合度值在0.5 ～ 0.7區(qū)間范圍可作為一種判定諸氏鯔蝦虎魚封閉群遺傳質(zhì)量是否合格的候選指標(biāo)，同時也發(fā)現(xiàn)封閉群與野生群平均遺傳雜合度差異較小，封閉群仍保持較高的雜合度，推測可能與以下因素有關(guān)：①該封閉群原始建群的P0代親本來自此野生群采樣地區(qū)，二者存在相似的遺傳基礎(chǔ)；②該封閉群始終保持較大的群體規(guī)模(大于6000尾)，且自建群起嚴(yán)格按照實驗動物要求繁殖和管理，有效保持了群體遺傳雜合度。同時對諸氏鯔蝦虎魚封閉群和野生群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，封閉群與野生群間遺傳分化較小，說明諸氏鯔蝦虎魚封閉群在遺傳背景上與此野生群存在關(guān)聯(lián)性，也側(cè)面證明該封閉群在培育過程中未發(fā)生近交。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)群體數(shù)量達(dá)到30尾以上，平均等位基因數(shù)趨于穩(wěn)定，與稀有鮈鯽封閉群的研究結(jié)果類似[23]，而對于平均有效等位基因數(shù)、平均觀測雜合度和平均期望雜合度等指標(biāo)，各個抽樣數(shù)量間差異不明顯，可能與本研究選用標(biāo)記多態(tài)性較高有關(guān)(僅有1個標(biāo)記為中度多態(tài)，其余均為高度多態(tài))。