基于網絡藥理學的安腸愈瘍湯治療潰瘍性結腸炎作用機制研究

樊靜娜

摘要：目的 ?基于網絡藥理學探討安腸愈瘍湯治療潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）的作用機制。方法 ?通過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺構建安腸愈瘍湯的潛在靶標與UC疾病靶標之間的相互作用網絡?；贕O數據庫和KEGG通路數據庫進行基因功能和通路富集，采用Cytoscape3.6.1軟件構建靶標-信號通路網絡、藥物活性成分-靶標網絡，采用熒光實時定量PCR對網絡藥理學主要分析結果進行驗證。結果 ?分析結果表明，安腸愈瘍湯靶點主要關聯(lián)UC炎癥因子及免疫調控，糖類、脂質和氨基酸代謝，能量代謝，神經-內分泌系統(tǒng)調節(jié)等;體外實驗提示，安腸愈瘍湯參與調控GCK、CROT介導的糖脂代謝，GNB1介導的炎癥通路，以及ATP1A1、COX7C介導的能量代謝、氧化磷酸化、線粒體電子呼吸鏈傳遞等通路。結論 ?安腸愈瘍湯治療UC具有多成分、多靶點的特點，可為進一步研究其作用機制提供依據。

關鍵詞：安腸愈瘍湯;潰瘍性結腸炎;網絡藥理學;作用機制

中圖分類號：R259.746.2;R2-05 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2020）01-0092-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201902170

Study on Mechanism of AnchangYuyang Decoction in Treating Ulcerative ColitisBased on Network Pharmacology

FAN Jingna

First Clinical Medical School， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China

Abstract： Objective To explore the mechanism of Anchang Yuyang Decoction in the treatment of ulcerative colitis （UC） based on network pharmacology. Methods The interaction network between UC targets and potential targets of Anchang Yuyang Decoction was constructed through Integrative Pharmacology-based Research Platform of TCM. Gene function and pathway enrichment were conducted based on GO database and KEGG pathway database. Cytoscape3.6.1 was used to construct target-signal pathway network and pharmaceutically active component-target network. The main results of network pharmacology were verified by real-time quantitative PCR. Results The results showed that the targets of Anchang Yuyang Decoction were mainly associated with inflammatory chemokines and immune system regulation in UC， carbohydrates， lipids and amino acid metabolism， energy metabolism， neuro-endocrine system regulation， etc. Vitro experiments indicated that Anchang Yuyang Decoction was involved in the regulation of glucose and lipid metabolism mediated by GCK and CROT， inflammatory pathway mediated by GNB1， as well as energy metabolism， oxidative phosphorylation， mitochondrial electron respiratory chain transmission mediated by ATP1A1 and COX7C. Conclusion AnchangYuyang Decoction applied for treating UC has the advantages of multi-components and targets， which can provide references for further research on mechanism.

Keywords： Anchang Yuyang Decoction; ulcerative colitis; network pharmacology; mechanism

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結腸和直腸黏膜彌漫性炎癥為特征的慢性非特異性炎癥性腸病。本病臨床癥狀以發(fā)作、緩解交替出現為特點，易復發(fā)，且部分重癥患者病情重、變化快，藥物治療效果不佳。目前，現代醫(yī)學對UC病因及發(fā)病機制未完全闡明，尚無針對其病因的特效藥物。中醫(yī)通過辨病與辨證相結合，抓住UC病機特點，隨證加減用藥，可顯著改善UC患者生活質量，維持疾病臨床緩解，防治并發(fā)癥，并降低疾病復發(fā)率^[1]。

安腸愈瘍湯是導師遲莉麗教授經多年臨床實踐總結的經驗方，藥用黃芪、薏苡仁、白術、黃芩、黃連、木香、檳榔、地榆、當歸、防風、白芍、白及、甘草，共奏扶正補虛、解毒安腸之功。臨床和實驗研究表明，安腸愈瘍湯能顯著改善UC患者臨床癥狀，減少病情復發(fā)，具有較好的抗炎和促進潰瘍修復的作用^[2-5]。因此，深入探討安腸愈瘍湯的作用靶點，分析其可能的作用機制，對于闡述安腸愈瘍湯的科學內涵具有重要作用。

中藥復方成分復雜，生物體生命活動規(guī)律的復雜性也限制了中藥現代研究的模式和方法。整合藥理學平臺在活性成分發(fā)現、作用分子機制闡釋、中藥質量標志物確認等方面有良好的應用前景，可通過整合中藥化學成分、疾病靶標構建“化學成分-作用靶標-疾病靶標-蛋白質相互作用網絡”^[6]，可從分子層面較好闡釋中藥方劑的作用機制。因此，本研究借助整合藥理學平臺，探討安腸愈瘍湯治療UC的可能作用機制，以期為安腸愈瘍湯的深入研究提供依據。

1? 資料與方法

1.1? 復方中藥成分及靶標檢索

中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺（http：//www.tcmip.cn/）中藥材數據庫依據2015年版《中華人民共和國藥典》，收錄400余味常用中藥材。通過該平臺逐一錄入安腸愈瘍湯各單味藥名稱，收集藥物所有化學成分，建立安腸愈瘍湯的化學成分數據庫，包括化合物編號、中英文名稱、分子式等。

1.2? 候選疾病靶標來源

在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺疾病/癥狀靶標數據庫中，以“colitis”“ulcerative”“IBD”作為疾病關鍵詞進行搜索，選取檢索出的藥物靶標基因、靶標蛋白等相關信息作為藥物候選靶標來源。

1.3? 靶標預測

通過OpenBabel軟件并應用MACCS（molecular access system）分子指紋技術提取藥物化學成分，對安腸愈瘍湯中化學成分二維結構（.mol）與Drug Bank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）中的藥物進行化學指紋特征比對，以Tanimoto系數定義的相似度計量方法進行相似性打分，取分數>0.8的藥物靶標為安腸愈瘍湯作用的潛在靶標。

1.4? 蛋白質-蛋白質相互作用信息

中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺鑲嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、In Act、HPRD、PDZBase、MINT、DIP等數據庫中蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）數據。通過該平臺的PPI數據庫，可直接獲得安腸愈瘍湯作用的潛在靶標與UC疾病靶標之間的PPI信息。

1.5? 網絡構建與分析

通過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺，針對安腸愈瘍湯作用的潛在靶標與UC疾病靶標之間的相互作用網絡，以節(jié)點連接度的2倍中位數為卡值，選取中藥靶標-疾病基因相互作用網絡的核心節(jié)點，同時選取滿足節(jié)點連接度（degree）、節(jié)點緊密度（closeness）和節(jié)點介度（betweenness）中位數的節(jié)點，構建安腸愈瘍湯的潛在靶標與UC疾病靶標之間相互作用的關鍵靶標網絡。

1.6? 基因功能和通路富集分析

中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺基于GO數據庫（Gene Ontology，http：//www.geneontology.org/）和KEGG通路數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.genome.jp/kegg/）資源，確定靶標基因、蛋白質分子功能、細胞內定位，及其所參與的生物學反應和通路，結合富集計算，得出安腸愈瘍湯的直接作用靶標和UC疾病的核心靶標，進行基因功能分析和通路分析，并將所得結果按P值降序排列，選取P值前20位的通路，構建“中藥方劑-中藥材-化學成分-核心靶標-關鍵通路”的多層次關聯(lián)網絡。借助Cytoscape3.6.1（http：//www.cytoscape.org）軟件構建疾病靶標-信號通路網絡、藥物活性成分-疾病靶標網絡。

1.7? 體外驗證實驗

1.7.1? 細胞與試藥

人結直腸腺癌HT-29細胞，中喬新舟有限公司。DMEM培養(yǎng)基（貨號10-013-CVR），CORNING公司;胎牛血清（FBS），LONSERA公司;青霉素-鏈霉素（P/S），HyClone公司;脂多糖（LPS），Sigma公司;TB Green Premix Ex Taq PCR試劑盒，TAKARA公司。安腸愈瘍湯，購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，取1劑，經水提、蒸發(fā)、濃縮至不流動的清膏，使用時稱取適量，溶解，過0.22 μm濾膜除菌后于-20 ℃保存。

1.7.2? 細胞培養(yǎng)及分組干預

HT-29細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS、1%P/S），37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞貼壁后取對數生長期細胞，分為3組。對照組：加入不含FBS、P/S的DMEM中孵育24 h;模型組：予LPS（20 μg/mL）孵育24 h^[7];實驗組：根據預實驗結果，在模型組干預基礎上予安腸愈瘍湯1 mg/mL孵育24 h。

1.7.3? 檢測指標及方法

Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，根據試劑盒說明書進行熒光實時定量PCR檢測。預變性引物見表1。

1.7.4? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1? 藥物化學成分靶標預測及分析

通過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺收集安腸愈瘍湯13味中藥共591種化學成分，通過與Drug Bank數據庫中的藥物進行比對，相似性分數≥0.8的靶標共3405個。各單味藥兩兩之間的共有靶標，除甘草外，黃芪、黃芩、檳榔、當歸、木香、白術、白芍、防風與其他藥味間的共有靶標均大于100個。

對安腸愈瘍湯候選靶標進行基因分析，取P值排名前20位，得到候選靶標的基因功能，涉及離子性谷氨酸受體信號通路、線粒體基質、蛋白質翻譯的tRNA氨?；?、線粒體內膜、氧化還原過程、氨基酸跨膜轉運活動、鳥氨酸循環(huán)、細胞色素C氧化酶活性、線粒體電子傳遞等。對安腸愈瘍湯候選靶標進行通路富集分析，取P值排名前20位，得到候選靶標參與的通路信息，主要涉及谷氨酸能突觸、氨基酸代謝、氨酰化tRNA的合成、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、谷氨酸代謝、輔酶因子和維生素的代謝、能量代謝等通路。

2.2? 基因功能和通路富集分析

通過GO數據庫分析，安腸愈瘍湯藥物靶標與UC疾病靶標基因功能有信號轉導、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、炎癥反應、老化、化學突觸傳遞、腺苷酸環(huán)素-G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、激活蛋白激酶A活性、胞質鈣離子濃度的調節(jié)、MAPK級聯(lián)反應、環(huán)磷酸腺苷的合成、缺氧反應、離子性谷氨酸受體信號通路、轉化生長因子受體信號通路、線粒體ATP合成質子傳輸等條目，見表2。

通過KEGG數據庫富集安腸愈瘍湯治療UC關鍵靶標所參與的通路主要涉及趨化因子信號通路、嘌呤代謝、核苷酸代謝、神經系統(tǒng)、核糖體、內分泌系統(tǒng)、谷氨酸能突觸、膽堿能突觸、ErbB信號通路等，見表3。

2.3? 中藥成分-靶標-通路多維網絡分析

基于PPI數據庫，構建安腸愈瘍湯潛在藥物靶標與疾病靶標相互作用網絡。根據條件篩選出關鍵靶標184個（見圖1），圖中節(jié)點大小與degree值成正比，其中疾病靶標主要有CCR9（趨化因子受體9）、IKBKB（IKKβ，NF-κB激酶亞單位β抑制劑）、HPRT1（次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）等，藥物靶標主要有CROT（肉毒堿?；D移酶）、GCK（葡萄糖激酶）、ATP1A1和ATP5C1（鈉/鉀轉運ATP酶）、COX7C和COX5B（細胞色素C氧化酶）、EPRS（雙功能氨酰-tRNA合成酶），這些藥物靶標主要涉及能量代謝、單核細胞和巨噬細胞的調控、脂肪酸及糖類代謝等。疾病靶標-信號通路網絡見圖2，疾病靶標-藥物活性成分網絡見圖3。大部分靶標及富集通路主要涉及能量代謝、炎癥趨化因子及免疫系統(tǒng)的調控、糖類、脂肪酸及氨基酸的代謝等。篩選核心節(jié)點前10位的疾病靶標，構建疾病靶標與活性化合物的網絡，其中共有活性化合物136種，安腸愈瘍湯中與疾病靶標關系密切的藥物主要為黃芪、黃芩、地榆、甘草、檳榔，藥物及其所含活性化合物數量依次為：黃芩（32）、地榆（31）、甘草（28）、黃芪（19）、檳榔（12）、白芍（7）、當歸（3）、防風（3）、白術（2）、木香（2）、黃連（1），其中黃芪皂苷、三萜類的鞣質、地榆皂苷、甘草皂苷、黃酮類物質、黃芩素、氨基酸等在活性成分中占主要比例。

2.4? 安腸愈瘍湯對LPS誘導的HT-29細胞GCK、CROT、ATP1A1、GNB1、ATP5C1、COX7C mRNA的影響

LPS作用24 h，GCK、CROT、GNB1表達下調，ATP1A1、COX7C表達上調（P<0.05），表明LPS可誘導活化各基因;安腸愈瘍湯干預后，GCK、CROT、ATP1A1、GNB1 mRNA表達升高（P<0.05），COX7C mRNA表達受到抑制（P<0.05）。ATP5C1 mRNA表達未見明顯變化。見表4。

3? 討論

UC屬中醫(yī)學“休息痢”“腸澼”“腸風”范疇，多因感受外邪，飲食不節(jié)，損傷脾運，或素體稟賦不足，情志內傷，脾虛運化失職，濕濁內生，積聚日久化為濕熱濁毒，蘊結腸腑，氣血凝滯，損傷腸膜脂絡而致。遲莉麗教授認為，虛、毒、瘀是UC的基本病機，以脾胃虛損為本，毒損腸絡、腸絡瘀阻為標，據此擬方安腸愈瘍湯，健脾益氣以扶正，祛濕解毒以祛邪，標本兼顧，共奏扶正補虛、解毒安腸之功，適用于UC脾虛毒戀證。實驗研究表明，安腸愈瘍湯可通過調控腫瘤壞死因子-α、白細胞介素（IL）-8等炎癥因子釋放及抑制核因子-κB通路等，減弱炎癥級聯(lián)反應并促進三葉因子3、黏蛋白2等促進黏膜修復^[8-9]。臨床研究顯示，安腸愈瘍湯能顯著改善UC患者臨床癥狀，減少病情復發(fā)，具有較好的抗炎和促進潰瘍修復的作用^[2-5]。

本研究通過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺收集安腸愈瘍湯中13味中藥化學成分和靶標，結果顯示，每味中藥可作用于多個靶標，多種中藥可同時作用于一個靶點，說明藥物間發(fā)揮作用有著密切的關系，各藥相須相使相輔相成。對基因功能和通路富集的分析顯示，安腸愈瘍湯對UC的干預作用主要涉及炎癥因子趨化，氨基酸、脂質代謝，神經-內分泌系統(tǒng)的調節(jié)，能量代謝等。通過構建安腸愈瘍湯潛在藥物靶標與疾病靶標相互作用網絡，篩選出關鍵靶標184個，其中疾病靶標主要有CCR9、IKBKB、HPRT1，藥物靶標主要有CROT、GCK、ATP1A1、ATP5C1、COX7C、COX5B、EPRS。通過構建疾病靶標-信號通路網絡，發(fā)現大部分靶標及富集通路主要涉及能量代謝、炎癥趨化因子及免疫系統(tǒng)的調控、糖類、脂肪酸及氨基酸的代謝等。UC在氨基酸代謝、脂類代謝、糖代謝等生理過程可能存在一定的紊亂。王敦方等^[10]利用超高液相色譜-質譜技術觀察黃芩湯對UC大鼠血清代謝譜的變化，發(fā)現UC模型大鼠能量代謝涉及的乳酸、肌酸，膽堿代謝產物如三甲胺，脂類代謝產物如棕櫚酸等均出現異常，應用黃芩湯干預后有趨向于正常水平的趨勢，尤其是纈氨酸、色氨酸、乳酸、尿素等物質代謝最為突出。本研究預測結果與文獻報道相符，提示應重視氨基酸代謝、脂類代謝、糖代謝在UC中的重要作用。篩選核心節(jié)點前10位的疾病靶標，構建疾病靶標與活性化合物的網絡，共有136種活性成分，安腸愈瘍湯中與疾病靶標關系密切的藥物主要為黃芪、黃芩、地榆、甘草、檳榔，其中黃芪皂苷、三萜類的鞣質、地榆皂苷、甘草皂苷、黃酮類物質、黃芩素、氨基酸等活性成分占主要比例。研究表明，黃芪多糖可調節(jié)UC大鼠血清炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13含量，調節(jié)IL-27和干擾素-γ，抑制Th17細胞分化，調節(jié)免疫平衡^[11-12]。甘草酸二胺具有與皮質類固醇類似的非特異抗炎作用，原皓等^[13]研究認為可能是通過上調外周血單個核細胞中Foxp3 mRNA的表達，抑制自身反應性淋巴細胞增殖，從而減輕炎癥反應。黃芩苷可通過調節(jié)p-STAT4/STAT4、p-STAT6/STAT6及相關細胞因子調節(jié)免疫平衡，緩解UC炎癥反應^[14]。

采用安腸愈瘍湯干預脂多糖誘導的HT-29細胞炎癥模型驗證網絡藥理學研究結果，發(fā)現安腸愈瘍湯可顯著上調GCK、CROT、ATP1A1、GNB1表達。GCK上調可提高細胞內糖類代謝水平，提高糖酵解效率。ATP1A1水平升高可提高細胞內能量代謝，增加細胞供能。CROT是細胞內脂質代謝中產生脂肪酰輔酶A重要的催化酶^[15-16]，其上調表明細胞內脂肪酸氧化代謝增強，與預測安腸愈瘍湯參與調控糖類、脂肪酸代謝相吻合。GNB1參與炎癥趨化因子調節(jié)通路，是JAK/STAT、MAPK等信號通路的重要啟動蛋白，研究發(fā)現GNB1介導Akt信號轉導并促進核因子-κB的活化^[17]。COX7C在新陳代謝、氧化磷酸化、線粒體電子呼吸鏈的傳遞中發(fā)揮重要作用，可能與GCK、ATP1A1共同參與細胞內的能量代謝調節(jié)過程。體外驗證實驗在一定程度上證實了網絡藥理學預測結果。

本研究基于網絡藥理學技術，采用整合藥理學平臺，建立了安腸愈瘍湯成分靶標-潰瘍性結腸炎靶標的分子生物網絡、復方中藥-成分-靶標-通路網絡，從多個角度探索安腸愈瘍湯治療UC的潛在分子機制。結果表明，安腸愈瘍湯可通過調控能量代謝，炎癥趨化因子及免疫系統(tǒng)，糖類、脂肪酸及氨基酸的代謝等多靶點、多途徑發(fā)揮治療UC的作用，其具體機制及物質基礎還需通過更深入的實驗研究加以驗證。

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（收稿日期：2019-02-21）

（修回日期：2019-03-23;編輯：陳靜）