滋陰益氣活血方對免疫性卵巢早衰小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1及PI3K相關(guān)蛋白表達的影響

黃姍姍　張韞玉　劉慧萍　張楚潔　陳沙　楊凱麟　肖小芹

摘要：目的? 觀察滋陰益氣活血方對免疫性卵巢早衰小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、PI3K、AKT1蛋白表達的影響，探討其改善卵巢功能的作用機制。方法? 取Balb/C雌性小鼠60只，隨機選取10只為空白組，其余50只用于造模。用透明帶3作抗原，皮下多點注射制作免疫性卵巢早衰動物模型。成模后實驗小鼠隨機分為模型組、陽性對照組和滋陰益氣活血方低、中、高劑量組，各給藥組給予相應藥物，連續(xù)給藥30 d。HE染色觀察小鼠卵巢組織病理形態(tài)，免疫組化檢測小鼠卵巢組織TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達。結(jié)果 ?與空白組比較，模型組小鼠卵巢組織TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠卵巢內(nèi)成熟卵泡數(shù)量均明顯增多，閉鎖卵泡數(shù)量相對減少，滋陰益氣活血方中、高劑量組和陽性對照組小鼠卵巢組織TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達明顯升高（P<0.01）。結(jié)論? 滋陰益氣活血方可改善模型小鼠卵巢功能，其機制可能與升高TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白的表達相關(guān)。

關(guān)鍵詞：滋陰益氣活血法;卵巢早衰;卵巢組織;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;PI3K;AKT1;小鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2020）01-0033-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906253

Effects of Ziyin Yiqi Huoxue Prescription on Expressions of TGF-β1 and PI3K Related Proteins in Premature Ovarian Failure Mice

HUANG Shanshan， ZHANG Yunyu， LIU Huiping， ZHANG Chujie，CHEN Sha， YANG Kailin， XIAO Xiaoqin

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To observe the effects of Ziyin Yiqi Huoxue Prescription on the expressions of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， PI3K and AKT1 proteins in immune premature ovarian failure mice; To explore its mechanism of action to improve ovarian function. Methods With 10 mice as blank group， fifty Balb/C female mice were subcutaneously injected with zona pellucida 3 as antigen to establish an animal model of immune premature ovarian failure. The model mice were randomly divided into model group， positive control group， Ziyin Yiqi Huoxue Prescription low-， medium-， and high-dosage groups. Administere groups were given the corresponding medicine. The medicine was administered continuously for 30 days. Pathological morphology of mouse ovary tissue was detected by HE staining. The expressions of TGF-β1， PI3K and AKT1 were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the blank group， the expressions of TGF-β1， PI3K and AKT1 protein in ovarian tissue of model group decreased significantly （P<0.01）; Compared with the model group， the number of mature follicles in ovaries in each administration groups increased significantly， and the number of atresia follicles decreased relatively. The expressions of TGF-β1， PI3K and AKT1 protein in Ziyin Yiqi Huoxue Prescription medium- and high-dosage groups and the positive control

group increased significantly （P<0.01）. Conclusion Ziyin Yiqi Huoxue Prescription can improve the ovarian function of model mice， and its mechanism may be related to the increase of expressions of TGF-β1， PI3K， AKT1 protein.

Keywords： Ziyin Yiqi Huoxue Prescription; premature ovarian failure; ovarian tissue; TGF-β1; PI3K; AKT1; mice

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指在青春期發(fā)育之后到40歲以前的女性，由于多種原因?qū)е露霈F(xiàn)的卵巢儲備功能衰竭的一類婦科疾病，表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕，并可能伴有圍絕經(jīng)期癥狀^[1]。常規(guī)檢查表現(xiàn)為垂體促性腺激素指標升高、雌激素指標降低。人類卵母細胞中PI3K通路中各信號分子異常表達會導致原始卵泡生存和發(fā)育的缺陷，造成卵巢的病理狀態(tài)^[2]。AKT1作為AKT的亞型之一，在身體各個組織均有表達^[3]，參與細胞的生存和生長調(diào)控^[4]。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β亞型之一TGF-β1是多種免疫細胞的自分泌和旁分泌因子，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展，是維持卵泡正常發(fā)育所必須的細胞調(diào)控因子，通過多種途徑在卵泡的生長、發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用^[5]。滋陰益氣活血方為湖南中醫(yī)藥大學尤昭玲教授經(jīng)驗方，長期用于婦科臨床，其治療遵循“未病先防、既病防變”原則，提倡早發(fā)現(xiàn)、早治療，用藥多以補腎為主，兼顧疏肝、健脾、活血，促使月經(jīng)來潮，恢復卵巢排卵功能。本實驗采用小鼠透明帶3（ZP3）作抗原，進行皮下多點注射建立免疫性POF小鼠模型^[6-7]，觀察滋陰益氣活血方對模型小鼠TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達的影響，為臨床治療POF提供依據(jù)。

1? 實驗材料

1.1? 動物

健康雌性Balb/C小鼠60只，SPF級，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，分籠喂養(yǎng)，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，光照12 h明暗交替，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

滋陰益氣活血方（熟地黃15 g，黃精12 g，枸杞子12 g，山萸肉12 g，當歸15 g，白芍12 g，川芎9 g，丹參12 g，桃仁9 g），飲片由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供;戊酸雌二醇片，1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號20181205。

1.3? 主要試劑與儀器

小鼠透明帶多肽溶液：小鼠ZP3第330～342個氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR），分析純度>90%，杭州中肽生化有限公司，批號P00105;弗氏完全佐劑，美國Sigma公司，批號F5881;弗氏不完全佐劑，美國Sigma公司，批號F5506;兔抗小鼠TGF-β1抗體（BA0290）、PI3K抗體（bs-0128R）、AKT1抗體（bs-0115R）和PV-9000通用型二步法檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號K173301A。LEICA DMLB2型雙目顯微鏡，LEICA RM2235全自動輪轉(zhuǎn)式切片機，LEICA HI1210攤片機，Motic BA410生物顯微鏡，MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，METTLER TOLEDO PL203型電子天平。

2? 實驗方法

2.1? 造模

取ZP3透明多肽粉6 mg，加入6 mL雙蒸水配成溶液，與弗氏完全佐劑按1∶1比例配制成免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按1∶1比例配制成免疫強化試劑。按文獻[8]方法，每只小鼠給予0.15 mL免疫試劑注射雙后腳掌處及腹腔皮下，14 d后給予免疫強化試劑0.15 mL再次注射雙后腳掌處及腹腔皮下加強免疫，建立免疫性POF模型?？瞻捉M小鼠則予0.15 mL生理鹽水注射相同部位。小鼠適應性喂養(yǎng)1周后開始造模，小鼠出現(xiàn)動情周期紊亂表示模型制作成功。

2.2? 分組及給藥

隨機選取10只小鼠為空白組，其余50只小鼠用于造模。將成模小鼠隨機分為模型組、陽性對照組和滋陰益氣活血方低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組），每組10只。中藥給藥劑量按人和動物體表面積換算成臨床成人用藥濃度1、2、4倍，低、中、高劑量分別為0.54、1.08、2.16 g/mL;戊酸雌二醇片按每人每日1 mg計算，根據(jù)小鼠與人體表面積進行換算，配成每1 mL含藥0.01 mg溶液。成模后小鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周開始給藥，空白組和模型組均給予生理鹽水0.3 mL灌胃，陽性對照組給予戊酸雌二醇水溶液0.3 mL灌胃，中藥低、中、高劑量組分別給予等體積藥液0.3 mL灌胃。連續(xù)30 d。

2.3? 體質(zhì)量和動情周期測定

定期記錄小鼠體質(zhì)量。從注射免疫試劑第8日開始，每日9：00對所有小鼠進行陰道脫落細胞涂片HE染色，鏡下連續(xù)7 d觀察小鼠動情周期。

2.4? 卵巢組織病理觀察

取卵巢組織，稱重，置于4%多聚甲醛溶液固定，脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋、切片、脫蠟，常規(guī)HE染色，制成病理切片。鏡下觀察卵巢內(nèi)正常卵泡和閉鎖卵泡的形態(tài)學變化。

2.5? 免疫組化檢測小鼠卵巢組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1、PI3K、AKT1蛋白表達

將固定好的卵巢組織，脫水、透明、浸蠟，完成石蠟包埋、切片、脫蠟，采用免疫組化檢測卵巢組織TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達。采用免疫組化半定量分析方法，鏡下選取陽性表達區(qū)域進行圖片拍攝，運用MIAS醫(yī)學圖像分析軟件分析圖片，取5個視野，測量平均灰密度值。

3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4? 結(jié)果

4.1? 滋陰益氣活血方對模型小鼠體質(zhì)量和動情周期的影響

免疫強化試劑注射后，模型組小鼠體質(zhì)量下降，給藥后中藥高劑量組和陽性對照組小鼠體質(zhì)量增長速度最快，中藥中、低劑量組小鼠體質(zhì)量增長幅度變化較大，模型組小鼠體質(zhì)量增長速度相對緩慢，見圖1。HE染色結(jié)果顯示，空白組小鼠有完整的動情周期（動情前期、動情期、動情后期和動情間期），與空白組比較，模型組小鼠動情周期紊亂，并一直處于動情前期或動情間期，見圖2。

4.2? 滋陰益氣活血方對模型小鼠卵巢組織形態(tài)的影響

空白組小鼠卵巢發(fā)育正常，組織結(jié)構(gòu)清晰，可見正常卵泡;模型組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)相對紊亂，卵巢內(nèi)成熟卵泡數(shù)量明顯減少，可見少量初級卵泡，閉鎖卵泡數(shù)量明顯增多;陽性對照組小鼠卵巢組織形態(tài)明顯改善，初級卵泡數(shù)量增多，可見少量閉鎖卵泡;中藥高劑量組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)相對正常，可見大量初級卵泡，閉鎖卵泡數(shù)量明顯減少;中藥中劑量組小鼠卵巢組織初級卵泡和成熟卵泡數(shù)量相對增多，閉鎖卵泡數(shù)量相對減少;中藥低劑量組小鼠卵巢組織形態(tài)有改變，可見多個閉鎖卵泡。中藥高劑量組和陽性對照組小鼠卵巢組織形態(tài)更接近空白組。見圖3。

4.3? 滋陰益氣活血方對模型小鼠卵巢組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1、PI3K、AKT1蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠卵巢組織TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達明顯下降（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠卵巢組織TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）。見圖4、表1。

5? 討論

有研究顯示，POF發(fā)病多與遺傳、自身免疫功能、婦科手術(shù)、放化療等因素有關(guān)^[9]。卵巢從形成到發(fā)育，其中任何一個環(huán)節(jié)的異常都可能導致POF，被發(fā)現(xiàn)時卵巢很可能已經(jīng)處于衰竭狀態(tài)^[10-11]。有研究表明，卵泡發(fā)育生長期間，通過誘導PI3K，可使AKT激活，將其運輸?shù)铰殉差w粒細胞胞質(zhì)或胞核中，引起下游相關(guān)信號因子活化，促進顆粒細胞增殖^[12]。有研究人員通過使用多種基因修飾小鼠，或?qū)Υ笫筮M行造模，在卵巢相關(guān)的生理和病理過程中對PI3K/AKT信號通路進行一系列實驗研究，發(fā)現(xiàn)各信號分子異常表達可導致原始卵泡生存和發(fā)育缺陷，表明其不僅參與卵泡發(fā)育、排卵，還參與其他卵巢相關(guān)疾病^[13]。通過針刺療法對POF模型大鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號通路mRNA和蛋白表達均升高，雌二醇分泌水平也相應提升，卵巢分泌激素功能恢復至正常水平，同時成熟卵泡數(shù)量增加，原始卵泡和大量初級卵泡功能恢復，表明PI3K/AKT信號通路對卵泡的生長和成熟起至關(guān)重要的作用^[14]。通過對TGF-β1與卵巢相關(guān)疾病的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在卵巢的不同發(fā)育階段均有表達，當表達正常時，對卵泡的發(fā)育及黃體的形成都有很好的促進作用，反之，會影響卵泡發(fā)育甚至排卵^[10，15-16]。TGF-β1不僅參與卵母細胞的成熟、顆粒細胞的增殖調(diào)節(jié)卵巢功能，還可能通過增強卵巢顆粒細胞對低劑量促卵泡激素刺激的敏感度^[17]，推進卵泡的生長及分化^[18]，這對維持卵巢內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用^[19]。在研究卵巢發(fā)育、卵泡生長過程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PI3K/AKT信號通路能刺激卵泡，使其加速生長，提高排卵率^[20-21]。在對女性生殖系統(tǒng)疾病研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可誘導人宮頸癌HeLa細胞獲得間質(zhì)細胞特征，并且作用于HeLa細胞后，激活PI3K/AKT信號通路，誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進其遷移和侵襲，表明TGF-β1可介導PI3K/AKT信號通路對女性相關(guān)疾病發(fā)揮一定的作用^[22]。TGF-β1除能通過經(jīng)典的TGF-β/Smad蛋白信號傳導途徑或絲裂原活化蛋白激酶等途徑對卵巢的顆粒細胞產(chǎn)生增殖和分化的調(diào)節(jié)作用，還能通過PI3K/AKT信號傳導途徑起到相應的調(diào)節(jié)作用^[23]。

POF可歸屬中醫(yī)學“血枯”“不孕”等范疇。治法主要是滋陰益氣活血。腎主藏精，其先天之精是生長發(fā)育生殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。腎精充，則腎氣足。卵巢功能退化也可歸結(jié)于腎虛精虧。腎氣虛，其激化作用減退，可致生殖之精無法化生導致精虧，人體生殖機能發(fā)生衰退。目前西醫(yī)治療本病多以雌激素為主，長期使用不良反應大。中醫(yī)藥有著多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)的整體調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，熟地黃、黃精等補腎藥有類雌激素作用，能改善POF引起的雌激素分泌不足，以此提高子宮內(nèi)膜的容受性，改善宮頸黏液的分泌，提高人體免疫力;川芎、桃仁等活血化瘀藥能改善盆腔微循環(huán)，增加子宮及卵巢的供血，使雌激素水平得到改善。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)組方可通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax系統(tǒng)平衡，調(diào)節(jié)免疫反應及細胞毒性淋巴細胞功能，促進B細胞、抑制外周血抗透明帶抗體等抗卵巢抗體聚集，減輕卵巢免疫炎性反應，改善卵巢功能^[24]。從免疫學的角度研究和總結(jié)了相關(guān)免疫細胞與POF的關(guān)系^[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組POF小鼠卵巢組織TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達明顯降低（P<0.01），卵泡閉鎖情況明顯增多。給予中藥治療后，TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白表達上升，其中，中藥中、高劑量組蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），陽性對照組表達最明顯，且優(yōu)于中藥中、高劑量組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。說明滋陰益氣活血方可能通過影響TGF-β1、PI3K、AKT1蛋白的表達來改善卵巢功能。有研究表明，TGF-β1誘導的自噬能通過TGF-β受體、Smad通路調(diào)控^[26]，敲除Smad2/3或Smad4后TGF-β誘導的自噬被抑制，但TGF-β也可通過PI3K/AKT激活mTOR通路，使自噬被激活^[27]，而且TGF-β1抑制或推動細胞的生長或凋亡，均與特定細胞存在的內(nèi)環(huán)境有關(guān)^[28]。在POF的內(nèi)環(huán)境，TGF-β1蛋白通過何種機制刺激或調(diào)控卵巢內(nèi)細胞自噬，我們將進一步研究和探索，也希望通過滋陰益氣活血方對相關(guān)蛋白表達作用的研究，為改善卵巢內(nèi)環(huán)境及POF的治療提供思路。

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（收稿日期：2019-06-17）

（修回日期：2019-07-07;編輯：華強）

基金項目：湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目重點項目（201801、201815）;湖南省自然科學基金面上項目（2018JJ2299）;湖南省教育廳創(chuàng)新平臺項目（18K069）;國家級大學生研究性學習與創(chuàng)新性實驗計劃項目（201810541001）;湖南省大學生研究性學習與創(chuàng)新性實驗計劃項目（2016-281、2018-400）;湖南省中醫(yī)方證研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室資助項目（2018TP1021）

通訊作者：劉慧萍，E-mail：1074983953@qq.com